恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的重大疾病。随着分子生物学的发展,基因治疗给恶性肿瘤患者带来了曙光,国外已把基因治疗作为恶性肿瘤常规治疗无效后的一种标准治疗尝试。自杀基因治疗是当前最有前景的肿瘤基因治疗方案,对肿瘤细胞具有特异性并能产生旁观者效应,理论上能完全消除肿瘤细胞达到治愈的效果,但由于尚存在载体转染效率低、靶向性不够等问题还没解决,因而未能达到预期的效果。如何有效的提高治疗效果,同时减少毒副作用是目前仍须解决的关键问题。增强旁观者效应能降低对高转染率的要求,减少载体及前体药物用量和毒性,增强基因治疗系统对肿瘤的杀伤力。因此,增强旁观者效应已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。目前主要采用基因转染法或药物诱导法以促进缝隙连接细胞通讯(GJIC)、诱导细胞凋亡或提高患瘤机体免疫功能等措施来提高自杀基因系统的旁观者效应。中药是一个天然药物宝库,中医研究肿瘤病学的历史源远流长,迄今为止,不少报道证实了中药在促进肿瘤GJIC、诱导癌细胞凋亡等方面都有独特的优势或潜力,加之价格低廉,给药方便,毒副作用较少,使其极有可能成为自杀基因疗法的有效增效成分,联合使用可发挥协同性抗肿瘤作用。研究目的意义：本研究选择被报道具有抗肿瘤作用的中药成分丹参酮ⅡA、丹参素钠和三七总皂甙,研究其对自杀基因系统是否有增效作用,在获得有明显作用的中药成分基础上进一步探讨其对肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡以及增强细胞缝隙连接通讯等方面的影响,以了解该有效中药成分增强旁观者效应的作用机制,探讨建立一种自杀基因疗法联合中药成分的中西医结合肿瘤基因治疗方案,为肿瘤治疗提供新的思路和模式。实验方法：1.中药活性成分对自杀基因旁观者效应影响的体外筛选：丹参酮ⅡA、丹参素钠和三七总皂甙成分各自以不同浓度单独或与GCV共同作用于大鼠肝癌细胞CBRH7919的10%tk+/tk-混合细胞,MTT检测各组抑制率,两两比较分析各组抑制率的差异和旁观者效应大小,用金正钧Q值分析中药与自杀基因系统联合的相互作用是否具有协同性。筛选出的活性中药成分,用小鼠黑色素瘤细胞B16的10%tk+/tk-混合细胞对其联合自杀基因系统的增效作用进行验证。2.丹参酮ⅡA联合自杀基因系统对小鼠移植性黑色素瘤细胞的治疗观察。实验分为模型对照组、丹参酮ⅡA组、GCV组和丹参酮IIA+GCV联合组;把tk+、tk-细胞按1：4比例混合接种C57BL／6J小鼠腋下皮下组织内,每只小鼠接种2×105个肿瘤细胞,次日雌雄均随机分组；接种后1-7天用中药治疗,7天后用自杀基因系统治疗7天,进行疗效观察。3.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞和小鼠黑色素瘤细胞的影响：以大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤B16两种细胞株为对象,采用MTT法从浓度依赖和时间依赖两方面检测有效中药成分对两种细胞生长的影响；形态学观察药物作用后细胞的形态变化；彗星电泳检测药物对细胞DNA的影响。4.采用流式细胞技术观察丹参酮ⅡA对HSV-tk/GCV系统的影响。检测丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤B16细胞周期和凋亡率的影响。PI单染法检测丹参酮ⅡA对10%CBRH7919/tk+和B16／tk+的影响：用终浓度为12.5μM、25、50μM的丹参酮ⅡA与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10% CBRH7919/tk+和B16／tk+细胞72h,各组细胞经收集后PBS洗2次,用预冷的70%乙醇固定后,PI染色,流式细胞仪进行凋亡率和细胞周期分析。5.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤细胞B16缝隙连接的影响。采用降落伞法观察丹参酮ⅡA对细胞GJIC的影响：培养板内的细胞用绿色荧光染料钙黄绿素(Calecin-AM)孵育,该染料在细胞内代谢后所产生的代谢产物可通过GJ进行传递。把被绿色荧光染料标记的细胞制成细胞悬液,使绿色荧光细胞像降落伞一样降落到无标记的细胞组内,通过观察绿色荧光染料在细胞内的传输判断药物对细胞GJIC功能的影响；在丹参酮ⅡA和HSV-tk/GCV联合的系统中加入GJ长效抑制剂甘草次酸,MTT法检测甘草次酸对联合系统的影响：加入丹参酮ⅡA至终浓度为0μM、12.5μM、25μM、50μM四个不同浓度组,GCV终浓度分别为OgM和15.7μM,甘草次酸浓度分别0、15μM,药物和GCV两个浓度分别联合,药物和GCV与甘草次酸的两个浓度分别联合,药物作用72h后MTT法测定肿瘤细胞对不同组别的敏感程度;分别用终浓度为12.5μM、25μM和50μM的丹参酮ⅡA作用CBRH7919细胞和B16细胞72h,然后采用RT-PCR和Western-blot技术检测各组细胞Cx43的表达量。实验结果：1.中药活性成分对自杀基因旁观者效应影响的体外筛选：各浓度丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV组的细胞抑制率(%)分别为30.38±5.28、33.22±5.21、40.58±4.49和73.04±2.85,与单纯10%tk+/GCV组(21.04±3.96)和相应的各浓度丹参酮ⅡA组(3.65±2.84、4.74±4.48、17.34±5.08和52.81±5.95)的抑制率明显提高。从其两两比较的表2可知,6.25μM、12.5μM、25μM和50μM浓度下的丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV组的实际抑制率显著高于理论抑制率,金正钧Q值分别为1.270、1.341、1.168和1.164,均大于1.15。用小鼠恶性黑色素瘤细胞以相同浓度的丹参酮ⅡA联合自杀基因重做该实验,结果表明,6.25μM、12.5μM、25μM和50μM浓度下的丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV组的实际抑制率显著高于理论抑制率,金正钧Q值分别为2.276、1.892、1.150和1.211,均大于1.15。说明丹参酮ⅡA对自杀基因系统具有增效作用,且该增效作用为协同作用。25μM浓度的丹参素钠联合10%tk+/GCV组的实际抑制率大于理论抑制率,金正钧Q值大于1.15,说明该浓度的丹参素钠对自杀基因系统具有增效作用。但50μM、100gM和200μM浓度下的丹参素钠联合10%tk+/GCV组的实际抑制率均低于理论抑制率,Q值均低于1.15,说明在此浓度范围内丹参素钠对自杀基因系统没有协同增效作用。100mg／L、200mg/L、400mg/L和800 mg／L浓度下的三七总皂甙联合10%tk+/GCV组的实际抑制率均低于理论抑制率,金正钧Q值均低于1.15,说明在此浓度范围内三七总皂甙对自杀基因系统没有协同增效作用。2.丹参酮ⅡA联合自杀基因系统对小鼠移植性黑色素瘤细胞的治疗观察。各组小鼠均在9-10日在右腋下触及肿块,自杀基因系统联合丹参酮ⅡA组治疗后,肿瘤生长速度减慢,肿瘤呈现生长抑制状态,平均肿瘤体积200.2 mm3,比模型对照组352.7 mm3减少43.24%(P<0.05),小鼠平均肿瘤质量0.278g,比模型对照组0.5628减少50.6%(P<0.05),统计学上差异有显著性意义。GCV组平均肿瘤体积比模型对照组减少34.76%(P<0.05)；小鼠的平均瘤块质量比模型对照组减少38.98%,但该结果没有统计学意义(P>0.05)。丹参酮ⅡA组平均肿瘤体积比模型对照组减少29.94%,小鼠的瘤块质量比模型对照组减少21.22%,但其肿瘤体积和质量与对照组相比都没有统计学意义(P>0.05)。以上结果提示：丹参酮ⅡA能提高自杀基因系统对小鼠移植瘤的杀伤力,协同自杀基因作用,达到提高自杀基因疗效的效果。3.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤B16的影响：CBRH7919和B16经梯度浓度丹参酮ⅡA(12.5μM、25μM和50μM)作用后都出现了不同程度的生长抑制,而且相关分析显示,这一抑制作用表现出一定的浓度和时间依赖性,浓度增加,或药物作用时间延长,都会使抑制率增加。倒置相差显微镜观察到CBRH7919和B16的对照组细胞生长状况良好,贴壁很稳,密度高,细胞呈梭状、菱形、三角形或多边形,药物作用后细胞生长增殖明显受到抑制,增殖缓慢,几乎停滞,细胞逐渐由贴壁而脱落,药物浓度越高脱落细胞越多。Hoechst染色后,可见CBRH7919的细胞形态变圆,折光性差,体积减小,细胞核皱缩、染色质浓缩,胞内多见颗粒,高浓度组可见数个圆形凋亡小体围绕在细胞周围,但未观察到B16细胞的死亡或凋亡现象。彗星电泳结果显示,大鼠肝癌细胞CBRH7919细胞和小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16经梯度丹参酮ⅡA(12.5μM、25μM和50μM)作用后,DNA发生损伤细胞后面形成长的拖尾,并呈典型凋亡彗星尾形态,平均光密度值较阴性对照均降低,差异具统计学意义,彗星尾距阴性对照均增加,差异具统计学意义,且二者的改变与作用浓度相关,即浓度越大,DNA受损伤的细胞越多。4.采用流式细胞技术观察丹参酮ⅡA对HSV-tk/GCV系统的影响。丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV作用于大鼠肝癌细胞CBRH7919时,S期细胞较对照组和GCV单独作用组都有了显著的增加,说明丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV可有效地使大鼠肝癌细胞CBRH7919阻滞在S期,抑制DNA的合成。25μM联合组的凋亡率是23%,50μM联合组的凋亡率则达到35%,是相应浓度丹参酮ⅡA或GCV单独作用时凋亡率的5倍,说明丹参酮ⅡA能大大增加自杀基因系统的杀伤能力,抑止肝癌细胞CBRH7919的生长,促进它的凋亡。药物对B16细胞周期的影响较少,但25μM和50μM联合组的流式图上均观察到亚二倍体凋亡峰,50μM联合组的凋亡率达到34%,说明丹参酮ⅡA可促进B16 (10%tk+/GCV)细胞系统的细胞凋亡,对自杀基因系统具有增效作用。5.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤细胞B16缝隙连接蛋白的影响。降落伞实验的结果显示,经过丹参酮ⅡA作用后,细胞之间出现了染料传输的现象,而且随着浓度的升高,含有绿色荧光的贴壁无标记细胞数量增多,提示丹参酮ⅡA极有可能具有增强细胞间GJIC的作用,而且浓度越高,效果越强；在丹参酮ⅡA和HSV-tk/GCV联合的系统中加入GJ长效抑制剂甘草次酸后,结果显示甘草次酸能显著下调丹参酮ⅡA与10%tk+/GCV的联合作用,使药物对细胞的抑制率降低,说明丹参酮ⅡA对自杀基因系统的增效作用机制很可能与改善细胞间缝隙连接细胞通讯有关；RT-PCR和Western-blot检测结果显示：高浓度(≥50μM)丹参酮ⅡA对CBRH7919细胞的Cx43mRNA和蛋白的表达有促进作用,而中、低浓度组则无明显上调作用；12.5μM、25μM和50μM的丹参酮ⅡA对B16细胞Cx43蛋白表达都有上调作用,但只有高浓度组对Cx43的mRNA表达有增强作用。实验结论：本文在细胞水平探讨了丹参酮ⅡA、丹参素钠和三七总皂甙三种中药活性成分对HSV-tk/GCV自杀基因疗法的旁观者效应,发现丹参酮ⅡA能有效增强自杀基因对细胞杀伤力,提高旁观者效应,而且有协同增效作用。丹参酮ⅡA还在小鼠移植瘤模型上得到了疗效验证：其联合自杀基因系统能明显抑制小鼠移植性黑色素瘤。通过体内实验对丹参酮ⅡA促进自杀基因旁观者效应的机制进行初步的研究,推测其增效机制可能是：丹参酮ⅡA作用于肿瘤细胞后在一定程度上恢复了Cx介导的GJIC功能,在一定程度上恢复或增强了细胞间的通讯,同时使肿瘤细胞阻滞于S期,令细胞毒素GCV-TP能更充分地起作用,进一步阻碍肿瘤细胞DNA的合成,使DNA发生损伤,并最终诱导细胞的凋亡。而细胞毒素则通过凋亡或细胞连接通讯的途径进入临近更多的细胞,从而使自杀基因的杀伤作用大大加强。本研究为探讨中药增强自杀基因旁观者效应的可行性及其机制研究打下了基础,今后将在待选中药中继续筛选更多针对不同旁观者效应机制的强效中药成分,对有效中药成分的药理机制深入研究,从GJIC、细胞凋亡、免疫调节等及其与旁观者效应的关系这一新领域阐明中药的抗肿瘤机制。还可望进一步把针对多种增效机制的多种中药成分联合组成比单一成分更高效的复方,形成组分与药理药效明确、质量稳定的鸡尾酒式肿瘤基因治疗增效中药复方。研究有利于促进肿瘤基因治疗的临床推广应用,为建立新的肿瘤基因治疗联合疗法提供了实验依据。