研究背景西洛他唑是1978年日本大冢制药有限公司合成的抗血小板类化合物,1988年作为治疗慢性动脉闭塞症的药物在日本上市。随着大型循证医学证实,西洛他唑可以显著改善慢性动脉闭塞症引起的下肢溃疡、疼痛、发冷和间歇性跛行等缺血性症状,1999年美国FDA批准其作为治疗稳定性间歇性跛行的药物上市。成为美国市场上第一个获得作为治疗该适应症的抗血小板聚集的药物；在临床上还被应用于治疗糖尿病等引起的外周血管性疾病。西洛他唑是一种选择性磷酸二酯酶3抑制剂,可抑制血小板及平滑肌内磷酸二酯酶的水解,增加细胞内cAMP水平,具有抗血小板聚集及血管扩张作用。近年来还发现西洛他唑有抗炎作用及抗平滑肌细胞增殖的作用,支架植入术后应用西洛他唑可减少新生内膜的增生和重构,有抗晚期血管再狭窄的作用。这些效应将作为西洛他唑抗血小板效应的补充且使之成为缺血性疾病独特的重要治疗。一、西洛他唑对动脉粥样硬化中血管内皮细胞的作用动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是常见的血管病变,是缺血性心脑血管疾病的常见原因,严重的危害着人类的健康。既往的观点认为,AS是机体脂质代谢障碍的结果,随着研究的深入,目前大多数学者认为AS是血管炎症性损伤的一种表现,认为AS是血管内皮细胞功能发生紊乱后的炎症反应及在此基础上的损伤-修复过程。血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells, VEC)既是血管内壁的一道机械屏障,又是一个具有高度活性的、位于血液和组织分界内表面的人体最大的内分泌器官。它具有细胞通透性、选择性屏障、止血、抗凝、纤溶、血液传输和血管活性物质代谢及调节血管运动张力、产生生长因子、纤维基质增生等作用,参与炎症反应,影响血管发生、血管通透性及液体平衡等。在动脉粥样硬化早期阶段,损伤部位活化的内皮细胞会分泌黏附分子和化学趋化因子,如血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1),导致免疫细胞和单核细胞聚集并迁移到血管壁内膜。VCAM-1在早期粥样硬化斑块形成时起主要作用,并且MCP-1是慢性炎症反应的媒介,二者可使单核细胞黏附。另外,活性氧与TNF-α也参与动脉粥样硬化的形成。有研究表明细胞核因子-κB (NF-κB)激活基因在人类动脉粥样硬化的血管中表达增高。作为一种新型的磷酸二酯酶3(PDE3)抑制剂,西洛他唑的基本作用是抗血小板聚集。它有许多额外的细胞作用靶点：可抑制PDE活性和阻碍环磷酸腺昔(cAMP)降解及转化,可预防动脉粥样硬化和血栓形成及血管阻塞；减少黏附分子的表达(如VCAM-1),抑制细胞因子释放和起效(如MCP-1、PDGF和]NF-α等),具有抗炎和抗动脉抗粥样硬化的作用；此外,通过提高细胞内cAMP水平扩张血管,促进血管内皮恢复和抑制血管增生,提高组织灌注,对缺血性脑组织起神经保护作用。研究发现西洛他唑对血管内皮细胞有明显的保护作用,MATSUMOTO等的动物实验表明西洛他唑能通过增加内皮依赖性超极化因子的反应来改善2型糖尿病大鼠肠系膜动脉内皮细胞的功能。进一步的研究表明,西洛他唑可能通过ERK1/2和P38MAPK依赖途径对抗由脂多糖介导的内皮细胞凋亡。除此之外,西洛他唑还有抑制炎症细胞对内皮细胞的黏附作用及抑制内皮细胞表达的作用,MORI等发现通过上调单核细胞cAMP的浓度,西洛他唑有抑制单核细胞对内皮细胞黏附的作用。二、西洛他唑对血管平滑肌细胞的作用血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)是血管壁的主要成分之一,是决定血管活性和血管构型的重要因素。其增殖在动脉粥样硬化、血管再狭窄和高血压等多种血管性疾病的形成机制中起着重要作用。在参与AS形成的细胞体系中,其中VSMC是增殖体系中最活跃的细胞。临床及实验研究均证实西洛他唑能够抑制VSMC增殖及预防冠状动脉介入治疗术后血管再狭窄。西洛他唑可以抑制由不同的生长因子,包括血小板衍生因子(PDGF)胰岛素和胰岛素样生长因子-1诱导的体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的增殖反应,也可抑制由PI3GF诱导的体外培养的人血管平滑肌细胞的增殖反应。近年来的研究还显示,血浆PAI-1的水平与冠心病、内膜增生和再狭窄密切相关,而西洛他哗能通过各种机制包括下调TGF-B, JNK和P38信号途径,抑制相关细胞因子的表达,从而起到抗血管平滑肌细胞增殖的作用。三、西洛他唑对丝裂原活化蛋白激酶的作用丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族属于高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,广泛分布于真核生物胞浆中。MAPK信号通路是一条细胞外信号引发细胞核内反应的重要途径,在细胞形成、分化、生长、增殖及凋亡过程中发挥着重要作用。目前发现MAPK家族有四条信号通路：即细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、c-Jun N端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、p38MAPK和ERK5/BMK1通路。经典的MAPK级联反包括3个激活步骤MAPK激酶激酶(mitogen-activated protein kinase ki-nase kinase, MAPKKK)激活后磷酸化并激活MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase, MAP-KK),接着MAPKK通过双重磷酸化邻近的苏氨酸和酪氨酸而激活MAPK,激活后的MAPK可由胞浆转运至细胞核内作用于靶目标。大量事实表明MAPK也是西洛他唑的作用靶点。研究目的西洛他唑目前在临床上广泛应用于血管性疾病包括缺血性心脑血管疾病的一级和二级预防,也是抗血小板药物治疗的基础。已有大量临床研究证实,西洛他唑可减少与动脉粥样硬化有关疾病的发生。血管内皮细胞功能障碍和血管平滑肌细胞增殖在动脉粥样硬化发生发展中起重要作用。本研究旨在分别观察西洛他唑对体外培养的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖及磷酸化P38MAPK丝裂原活化蛋白激酶表达的影响,以进一步从细胞和分子水平上阐述西洛他唑对动脉粥样硬化血管的保护作用。研究方法1.96孔板上体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用MTT法确定细胞的增殖状态。2.体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926,用不同终浓度的西洛他唑(10.30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。3.在96孔板上体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用终浓度为10、30、100、300umol/l的西洛他唑分别作用24小时并设立对照进行比较,采用CCK-8法确定细胞的增殖状态。4.体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC,用不同终浓度的西洛他唑(10、30、100、300umol/l)刺激24小时并设立对照组进行比较,裂解细胞提取蛋白,考马斯亮蓝G-250染色法测定总蛋白浓度,利用P38磷酸化抗MAPK抗体的蛋白免疫印记法测定磷酸化P38MAPK蛋白表达。研究结果1.采用MTT法确定人脐静脉血管内皮细胞的增殖状态：各组细胞增殖率分别为对照组0.909±0.012, CLZ10μmo/L组0.904±0.026; CLZ30μmol/L组0.851±0.023; CLZ100μmol/L组0.670±0.013; CLZ300μmol/L组0.651±0.036。统计分析显示30μmol/L、100μ mol/L和300μ mol/L的CLZ分别能明显抑制HUVECs的增殖(P<0.05),并呈剂量依赖性。2.西洛他唑对人脐静脉血管内皮细胞中磷酸化P38MAPK蛋白表达的影响：以对照组的密度扫描结果为100,10μmol/L西洛他唑对磷酸化P38MAPK蛋白没有明显的作用(96.3±6.0, P>0.05)。30μ mol/L100μ mol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(92.5±2.4,72.6±5.2,70.6±3.3,P<0.05)。3.采用CCK-8法确定大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的增殖状态：各组细胞增殖率分别为对照组0.835±0.022, CLZ10μmo/L组0.830±0.017; CLZ30μmol/L组0.796±0.022; CLZ100μmol/L组0.605±0.003; CLZ300μmol/L组0.581±0.032。统计分析显示100μmol/L和300μmol/L的CLZ分别能明显抑制大鼠血管平滑肌细胞的增殖(P<0.05)。4.西洛他唑对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞中磷酸化P38MAPK蛋白表达的影响：以对照组的密度扫描结果为100,10μ mol/L,30μmol/L的西洛他唑对磷酸化P38MAPK蛋白没有明显的作用(99.8±2.4,99.8±3.8,P>0.05)。100μmol/L及300μmol/L的CLZ均能够明显抑制磷酸化P38MAPK蛋白的表达(86.7±1.6,77.9±2.3,P<0.05)。研究结论本研究提示西洛他唑通过部分抑制血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中磷酸化P38MAPK蛋白的表达而对体外培养的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞增殖产生一定的抑制作用,这一效应可能是西洛他唑在缺血性心脑血管疾病治疗中的重要机制,不仅是对西洛他唑应用于外周血管疾病的重要补充,也是西洛他唑成为预防和治疗动脉粥样硬化提供了一定的实验依据。