论文一妊娠4-8周母体甲功正常甲状腺自身免疫与亚临床甲减对低危妇女流产影响的前瞻性队列研究　　背景:　　近20年，单纯性甲状腺自身免疫、亚临床甲减与不良妊娠结局的相关性成为内分泌学界、围产医学界共同关注的热点问题。研究表明单纯性甲状腺自身免疫、亚临床甲减可导致不良妊娠结局如流产、早产;胎儿脑发育障碍、后代智力水平可能降低，以及产后甲状腺炎发生风险增加。当前，证据较多的是二者是流产、特别是复发性流产的危险因素。然而，在妊娠早期针对甲状腺疾病的低危人群进行甲状腺自身免疫和亚临床甲减筛查，评估其对流产的影响尚未见报告。　　目的:　　本研究旨在观察妊娠4-8周甲状腺疾病低危妇女单纯性甲状腺免疫、亚临床甲减与妊娠20周前发生流产的相关性。　　方法:　　共筛查3315例妊娠4-8周妇女，采集空腹血液标本，空腹静脉促凝血分离血清，测定甲状腺功能[TSH和FT4(Free thyroxine)]和甲状腺自身抗体[甲状腺过氧化物酶抗体(Thyroid peroxidase antibody，TPOAb)和甲状腺球蛋白抗体(Thyroglobulin antibody，TgAb)]。基于上述结果将研究人群分为4组:(1)甲功正常、甲状腺自身抗体阴性组(euthyroidism，ET);(2)单纯亚临床甲减组(isolated subclinical hypothyroidism，SCH);该组依据TSH水平分为两个亚组:SCH1组2.5≤TSH＜5.22 mIU/L; SCH2组5.22≤TSH＜10 mIU/L;(3)单纯甲状腺自身免疫组（isolated thyroid autoimmunity，isolated TAI）: TPOAb和/或TgAb阳性;(4)亚临床甲减合并甲状腺免疫组(SCH+TAI)，该组依据TSH水平分为SCH+TAI1和SCH+TAI2两个亚组。研究终点为妊娠20周前发生的流产。　　结果:　　1.与ET组相比，SCH2组（7.1 versus2.2％，矫正危险度[aOR]3.40(95％可信区间[CI]:1.62-7.15;P=0.002)、isolated TAI组(5.7 vs2.2％，aOR2.71，95％CI1.43-5.12;P=0.003),SCH+TAI1组(10.0 vs2.2％, aOR4.96,95％ CI2.76-8.90;P=0.000)与SCH+TAI2组(15.2 vs2.2％, aOR9.56,95％ CI3.76-24.28;P=0.000)流产风险均增加，而SCH1组显示出无统计学意义的流产风险增加(3.5versus2.2％, aOR1.62,95％ CI0.96-2.73;P=0.083)。　　2.存在甲状腺免疫和/或亚临床甲减的妊娠妇女流产发生的妊娠周数较ET组（11.13±3.21周）提前，在SCH1组为（10.79±1.77）周(P=0.046);SCH2组为（9.70±1.47）周(P=0.02);单纯性TAI组为（9.91±1.74）周(P=0.033);SCH+TAI1组为（9.59±1.97）周（P=0.022）;SCH+TAI2组为（8.88±1.24）周(P=0.020)。　　结论:　　妊娠4-8周甲状腺自身免疫、亚临床甲减妇女流产风险增加，且二者使流产发生的妊娠周数提前。这两种情况共存的妊娠妇女发生流产的风险最高。　　论文二甲功正常甲状腺自身免疫流产动物模型的建立　　背景:　　研究表明单纯性甲状腺自身免疫可导致妊娠妇女流产风险增加，其机制至今未明。理想动物模型的建立是深入研究疾病的发病机制、探索有效治疗措施的途径之一。对于甲状腺自身免疫的流产动物模型曾有相关报道，但流产动物的甲功检测表明出现了甲减或亚临床甲减的表现，故流产不能除外由甲功改变所致的影响，为此，建立甲功正常的单纯甲状腺自身免疫的流产动物模型对甲状腺自身免疫导致流产的机制的研究至关重要。　　目的:　　构建甲功正常的单纯TgAb阳性的甲状腺自身免疫CBA/J孕鼠流产动物模型。　　方法:　　本研究以25μg与75μg剂量的小鼠甲状腺球蛋白(mTg)免疫CBA/J雌鼠，诱导自身免疫性甲状腺炎动物模型，甲状腺内呈淋巴细胞浸润，体内可检测到较高滴度TgAb，与Balb/c雄鼠交配，于妊娠13.5天比较各组TgAb、甲状腺淋巴细胞浸润评分、甲功、胚胎吸收率和受孕率。　　结果:　　1.Con组、25μg与75μg mTg免疫CBA/J孕鼠TSH、TT4各组间无差异(P＞0.05);　　2.25μg与75μg mTg免疫CBA/J孕鼠自身免疫性甲状腺炎发病率、甲状腺淋巴细胞浸润评分与Con组相比明显增加(P＜0.05);25μg与75μg两组间比较，75μg mTg免疫组较高（58.7％ vs72.1％，P＜0.05）;　　3.25μg与75μg mTg免疫CBA/J孕鼠血清TgAb滴度均Con组明显增高;25μg与75μg两组间比较，75μg mTg免疫组血清TgAb滴度更高，但两组间无统计学差异(P＞0.05);　　4.25μg与75μg mTg免疫CBA/J孕鼠胚胎吸收率较Con组明显增高(33.3％vs3.1％，P＜0.05)(45.63％ vs3.1％，P＜0.05)，比较25μg与75μg mTg免疫两组胚胎吸收率无统计学差异(P＞0.05);　　5.25μg与75μg mTg免疫CBA/J孕鼠受孕率较Con组明显降低(65.3％ vs93.1％，P＜0.05)(55.63％vs93.1％，P＜0.05)，比较25μg与75μg mTg免疫两组受孕率无统计学差异(P＞0.05)。　　结论:　　1.mTg免疫可以使CBA/J小鼠致甲状腺自身免疫，在妊娠13.5日仍存在淋巴细胞浸润，免疫后孕鼠胚胎吸收率明显增加，受孕率降低，但两个免疫剂量之间并无差异;　　2.mTg免疫后小鼠体内均出现较高抗体，免疫剂量增加抗体滴度也增加，但25μg与75μg两种剂量免疫所产生抗体滴度无差异;　　3.75μg mTg免疫CBA/J小鼠可诱导甲功正常单纯TgAb阳性的自身免疫异基因交配的流产动物模型。　　论文三 PD-1/PD-L1抑制途径在甲功正常甲状腺自身免疫诱导小鼠流产中对母胎耐受的影响　　背景:　　无论是临床试验，还是动物模型，均表明抗体阳性的自身免疫性甲状腺炎与流产相关，然而，具体机制尚未阐明。妊娠是一个精细而复杂的生理过程，类似于同种异体移植，作为同种移植物的胚胎在母体内存活直至分娩，实际上反映母体对胚胎抗原的免疫耐受，这种母胎耐受包括母胎界面免疫耐受及外周免疫耐受，一旦免疫耐受被打破，母体对胎儿表现为免疫排斥，将导致流产的发生。程序性细胞死亡分子-1（programmed cell death-1，PD-1）/程序性死亡配体(programmed celldeath ligand，PD-L)共刺激途径是近年发现的负性共刺激通路，由于其独特的抑制功能备受瞩目。PD-1（也称CD279），属于免疫球蛋白超家族成员，表达较为广泛。PD-1有PD-L1和PD-L2两种配体，多项研究表明通过干预PD-L2并没有观察到预期的免疫调节作用，而PD-L1（也称B7-H1或CD274）在多种免疫细胞组成性表达，在免疫豁免部位，如胎盘也有表达，PD-L1的广泛表达也提示它对外周免疫耐受、母胎耐受的形成与维持具有重要意义。　　目的:　　本研究旨在观察PD-1/PD-L1抑制途径在母体单纯性TgAb阳性诱导小鼠流产中的作用。　　方法:　　以75μg mTg免疫CBA/J雌鼠，诱导异基因交配自身免疫性甲状腺炎孕鼠流产模型，弗氏佐剂免疫作为对照组。　　留取血清，取完整甲状腺组织，多聚甲醛固定制作石蜡切片苏木素和伊红(Hematoxylin and eosin，HE)染色。取胎盘、脾制成单细胞，免疫荧光染色、流式细胞学检测Treg、Th17细胞及PD-1与PD-L1在上述细胞中的表达。实时定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative Real-Time Reverse Transcripte Polymerase ChainReaction, real-time RT-PCR)法检测叉头蛋白P3(forkhead box P3，Foxp3)、视黄酸受体相关孤儿受体γt（Retinoic acid receptor-related orphan receptorγt，RORγt）和白细胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)的信使核糖核酸(Messenger ribouncleicacid，mRNA)在胎盘、脾细胞表达水平。　　结果:　　1.mTg免疫CBA/J孕鼠胎盘Treg细胞比例低于对照组，同时孕鼠胎盘Foxp3mRNA水平亦低于对照组(P＜0.05)，而CD4+亚群中CD25Foxp3+细胞比例在两组间无差异(P＞0.05)，CD25Foxp3细胞在两组间也无差异(P＞0.05);mTg免疫CBA/J孕鼠脾脏Treg细胞比例低于对照组(P＜0.05)，同时孕鼠脾脏Foxp3mRNA水平亦低于对照组（P＜0.05），CD4+亚群CD25-Foxp3+细胞在两组间无差异(P＞0.05)，CD25-Foxp3-细胞在两组间也无差异(P＞0.05)。　　2.mTg免疫CBA/J孕鼠胎盘Th17细胞比例高于对照组(P＜0.05);mTg免疫CBA/J孕鼠脾脏Th17细胞比例与对照组相比无统计学差异(P＞0.05)，同时孕鼠脾脏IL-17 mRNA水平与对照组相比亦无统计学差异（P＞0.05）;mTg免疫CBA/J孕鼠Tre g/IL-17比例在胎盘增高(P＜0.05)。　　3.PD-1在mTg免疫CBA/J孕鼠的胎盘与脾的CD4+T细胞中表达的比例增加(P＜0.05)，在CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞中表达的比例增加(P＜0.05)，PD-L1在mTg免疫CBA/J孕鼠的脾脏与胎盘的CD4+T细胞中表达的比例降低(P＜0.05)，在CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞中表达的比例降低(P＜0.05);mTg免疫CBA/J孕鼠的胎盘与脾脏的PD-1 mRNA水平亦高于对照组(P＜0.05)，胎盘与脾脏的PD-L1 mRNA水平亦低于对照组（P＜0.05）。　　结论:　　PD-1/PD-L1抑制途径可能通过调节Treg细胞及Treg与Th17的表达失衡而引起甲功正常的TgAb阳性孕鼠母胎耐受、外周耐受失衡，参与了流产的发生。