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研究目的检测软脂酸(PA)对肾小管上皮细胞Toll样受体4(TLR4)及其下游炎症因子IL-6和TNF-ɑ表达的影响,探讨游离脂肪酸(FFAs)在引发肾脏微炎症反应的相关作用机制。实验方法用含有软脂酸浓度为(0μ mol/L、125μ mol/L、250μ mol/L、500μ mol/L)的DMEM培养液对正常的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)进行干预。①于干预24小时后观察NRK-52E的形态学的变化;②采用MTT法检测不同浓度的软脂酸干预12h,24h后NRK-52E的增殖情况;③相同条件下培养细胞12h,24h,应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)检测肾小管上皮细胞TLR4mRNA水平;④用流式细胞术仪(flow cytometry,FC)检测软脂酸干预24小时后NRK-52E表面TLR4的蛋白水平;⑤采用酶联免疫吸附试验检测软脂酸作用12h,24h后不同浓度组上清液中白介素-6(IL-6)与肿瘤坏死因子-α (TNF-ɑ)的表达情况。主要结果1.NRK-52E细胞形态正常NRK-52E细胞为类圆形的贴壁细胞,铺满、融合后细胞呈铺路石状贴壁生长。经24小时不同浓度软脂酸干预后,由紧密连接的类圆形细胞拉长为连接松散的梭形细胞,其中500μ mol/L浓度的软脂酸干预后细胞变化尤为明显。2.MTT检测细胞增殖细胞处理12h,24h终点时:d-BSA组与空白对照组相比,无统计学差异(p>0.05),说明d-BSA作为软脂酸与NRK-52E细胞结合的载体,对NRK-52E细胞的增值不产生有意义的影响;各软脂酸组与空白对照组比较,OD值明显减小,且有显著的统计学差异(P<0.01);三组不同浓度软脂酸组之间两两比较,OD值随着软脂酸浓度的增加逐渐减小,且各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。相同浓度组不同时间段比较:24小时较12小时OD值有所降低,且各组均有统计学差异(P<0.05)。3.PCR检测结果细胞处理12小时结果:不同组之间细胞内TLR4的mRNA表达量总体有差别,差异有统计学意义(P<0.05);PA125μ mol/L组与d-BSA对照组相比TLR4的mRNA表达上调,且差异有统计学意义(P<0.05);PA250μ mol/L组与d-BSA对照组及PA125μ mol/L组相比TLR4的mRNA表达上调,但与PA125μmol/L组之间差异无统计学意义,可能在软脂酸干预的早期,这两组浓度软脂酸不足以引起TLR4的mRNA的差异性表达;PA500μ mol/L组与其它任意组比较,TLR4的mRNA表达明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05);综上说明在干预12小时终点时,TLR4的mRNA表达随着软脂酸浓度增高而增加,且在500μ mol/L浓度时其表达更是明显增加。细胞处理24小时结果:不同组之间细胞内TLR4的mRNA表达量总体有差别,差异有统计学意义(P<0.05);PA125μ mol/L组与d-BSA对照组相比、PA250μ mol/L组与PA125μ mol/L组相比、PA500μ mol/L组与PA250μ mol/L组相比表达均上调,且差异均有统计学意义(P<0.05),说明在干预24小时终点时,TLR4的mRNA表达与软脂酸的浓度之间呈一定的浓度依赖关系。相同浓度组不同时间段比较:24小时较12小时表达有所增高,其中PA250μ mol/L组与PA500μ mol/L组均有统计学差异(P<0.05)。4.流式细胞仪检测结果不同浓度的软脂酸处理肾小管上皮细胞24h后,与对照组相比细胞膜TLR4蛋白水平明显增高,并随浓度增高而增加,且差异有统计学意义(P<0.05),三组不同浓度软脂酸组之间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。5.ELISA方法检测结果细胞处理12h,24h终点时:d-BSA组与空白对照组上清液中可检测到微量IL-6、TNF-ɑ,两组相比,差异无统计学意义(p>0.05);12小时低浓度IL-6组与空白对照组比较,分泌有所增加,但差异无统计学意义(p>0.05);其余各软脂酸组干预组与空白对照组比较且各组两两比较,有的统计学差异(P<0.05),且IL-6、TNF-ɑ的分泌随PA浓度的增加明显增多;相同的处理浓度,干预24小时组较干预12小时组IL-6、TNF-ɑ的分泌明显增多,且差异有统计学意义(P<0.05)。主要结论1.肾小管上皮细胞的生长、增殖受到软脂酸作用的影响。并且在12h及24h,0μ mol/L-500μ mol/L浓度范围内软脂酸的浓度与细胞的增殖呈负相关。2.软脂酸可诱导肾小管上皮细胞TLR4mRNA的表达增高。3.软脂酸诱导肾小管上皮细胞膜上TLR4蛋白的表达增高。4.软脂酸可以促进肾小管上皮细胞IL-6及TNF-α的分泌,且IL-6、TNF-α分泌的高峰与TLR4mRNA及在细胞膜上蛋白表达的高峰基本接近,提示IL-6、TNF-α的增高可能与细胞膜上TLR4蛋白的表达有关,进一步推论,可能是软脂酸通过作用TLR4而间接促发炎症因子IL-6、TNF-α的表达。