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RSL1D1(ribosomal L1-domain-containing 1),即细胞衰老抑制基因(CSIG,cellular senescence-inhibited gene),编码一种核糖体蛋白,属核糖体L1p/L10e家族。RSL1D1蛋白主要定位于核仁,在其N端和C端分别含有核糖体L1结构域和赖氨酸富集区。研究表明,RSL1D1具有抑制细胞衰老、调节细胞凋亡和细胞增殖的功能。最近,本课题组发现RSL1D1可能与p53之间存在相互作用,推测RSL1D1可能在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。本研究旨在阐明RSL1D1在肿瘤细胞中的功能及其与p53之间的相互作用,为最终解析RSL1D1与肿瘤发生发展之间的关系提供重要实验依据。首先,本项目研究了 RSL1D1表达水平的下调对肿瘤细胞增殖速率的影响。利用常规分子生物学技术构建慢病毒重组质粒pLKO.1-shRNA,包装用于敲低RSL1D1的慢病毒颗粒,感染人直结肠癌细胞HCT116,经抗生素筛选,获得敲低RSL1D1的稳定HCT116细胞株,并通过绘制生长曲线,分析RSL1D1的敲低对HCT116增殖速率的影响。结果发现,与对照组相比较,RSL1D1被敲低后,HCT116的增殖速率明显下降。接着,利用流式细胞术分析了 RSL1D1的表达下调对细胞周期的影响。将上述制备的RSL1D1被敲低的HCT116细胞经乙醇固定,利用PI染色法进行染色,然后利用流式细胞仪分析细胞周期。结果发现,和对照组相比较,RSL1D1的敲低导致Sub-G1的明显增加,表明RSL1D1的敲低促进细胞凋亡,提示RSL1D1具有促进肿瘤细胞生存的功能。然后,研究了 RSL1D1的表达下调与细胞凋亡信号途径关键分子Bax和Puma表达水平之间的关系。收集上述制备的RSL1D1被敲低的HCT116细胞,利用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测Bax和Puma的mRNA和蛋白质水平。结果显示,RSL1D1的表达下调后,作为p53下游靶基因的促凋亡因子Puma的mRNA和蛋白质水平明显升高,而Bax的蛋白质水平则没有明显变化,尽管其mRNA水平略有上升。本研究还发现RSL1D1的敲低导致p53负调控因子HDM2的蛋白质水平明显上升。提示RSL1D1可能通过抑制HDM2,从而调节p53的胞内水平和活性,并进一步通过抑制Puma促进肿瘤细胞的生存。最后,研究了 RSL1D1与p53之间的相互作用。通过基因重组技术将编码全长RSL1D1、RSL1D1(1-281)、RSL1D1(282-485)、RSL1D1(387-490)的核苷酸序列克隆至原核表达载体pGEX-5X-1或pGEX-6P-1,同时将全长p53基因克隆至另一原核表达载体pET-32a。将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶或镍琼脂糖凝胶纯化融合蛋白,用于研究RSL1D1与p53之间的相互作用。结果发现,RSL1D1能在体外与p53直接结合,并确定RSL1D1(387-490)参与结合p53。综上所述,本项目的一系列研究结果揭示,RSL1D1可能通过直接与p53结合,调节p53的活性及Puma的胞内水平,从而调节肿瘤细胞的增殖与生存。这对于深入理解RSL1D1和p53在肿瘤发生发展中的作用,为肿瘤治疗提供新思路与新靶点具有重要意义。