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目的:建立人大肠癌HCT-8多药耐药细胞株HCT-8/5-FU,探讨穿琥宁对HCT-8/5-FU细胞株的影响。 方法:先采用较大剂量间歇诱导进行筛选,再采用浓度梯度递增法作用,历时约7个月,至HCT8细胞可长期在2.0ug/mL5-FU中稳定生长。体外细胞毒性实验观察它对5-FU、ADM、DDP的敏感性。绘制两种细胞的体外生长曲线。光镜、电镜、HE染色观察两种细胞形态结构差异。罗丹明染色法检测其两种细胞P-糖蛋白功能表达。绘制0.4mg/mL,1.2mg/mL,2.4mg/mL穿琥宁作用下的HCT-8/5-FU生长曲线,MTT法检测上述浓度下的细胞抑制率。MTT法、流式细胞仪PI染色法检测穿琥宁与化疗药物联合作用下,对耐药细胞的毒性作用和凋亡率。流式细胞仪罗丹明染色法和PI染色法初步探讨穿琥宁的作用机制。 结果: 一 HCT-8细胞株经7个月诱导,可在2.0mg/mL的5-FU中稳定增殖,并获得了多药耐药性,命名为HCT-8/5-FU,该细胞株对5-FU的耐药指数为16.6,并对ADM、DDP有交叉耐药性。 二 该细胞株体外群体生长时间与亲本细胞差别不显著。耐药细胞株与亲本细胞比,贴壁较紧。相差显微镜镜下,耐药细胞胞体较亲本细胞大,细胞核不规则,可见双核、多形核,细胞形态不规则,呈多角形、细长形改变,可见巨核细胞。透射电镜下线粒体、内质网、溶酶体增多。 三 流式细胞仪罗丹明染色法观察荧光强度曲线左移,提示耐药细胞有过度P-170过度表达。 军医进修学院硕士学位论文 四0.4。g/mL组生长曲线与正常对照组无明显差别,1.Zing/。L穿掳宁对细胞生长有轻度抑制作用,2.4mg砌L浓度有一定抑制,但细胞仍可生长。MTT法检测 0.4mg/mL、1.Zing/。L、2.4mg加L穿掳宁作用下,耐药细胞株的抑制率分别为7.2兄13.2“ZI儿差异有显著意义。 五MTT法和流式细胞仪PI观察到:与单独应用5-FU、ADM、DDP相比,1.Zing加L穿掳宁与上述药物联合作用,抑制率及凋亡率均增高。罗丹明染色法提示穿掳宁的作用机制可能与影响卜 170的活性有关。但穿掳宁本身并不诱导凋亡,对细胞周期也无影响。 结论: 一本研究成功建立HCT-8/M多药耐药细胞株,对5-FU、ADM、DDP产生耐药,是研究大肠癌MDR的理想模型。 二先采用较大剂量间歇诱导进行筛选,再采用浓度梯度递增法作用是诱导大肠癌耐药细胞株的较好方式。 三罗丹明活细胞染色法提示 HCT-8/W细胞株的耐药机理可能与卜糖蛋白过度表达有关。 四终浓度1.Zing/mL的穿掳宁对HCT-8/W细胞无明显抑制作用。 五穿琉宁与5-FU、ADM、DDP联合作用,可增加上述化疗药物的毒性作用,使肿瘤细胞的凋亡率增高。穿掳宁在一定程度上可逆转HCT《/W细胞的耐药性。 六穿掳宁本身并不诱导凋亡,对细胞周期也无影响,但它可能影响卜糖蛋白功能,这可能是它的逆转机制之一。