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H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)属于低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus,LPAIV),但与很多其他病原混合感染时会产生致病协同作用,从而导致感染鸡群严重发病。目前,H9N2亚型AIV在国内鸡群中的流行非常普遍,即使在抗体水平很高的免疫鸡群仍然经常发现感染带毒现象,严重的还会导致临床发病,分析认为可能与流行毒株的变异导致抗原性与疫苗毒株间存在一定的差异有关。因此,通过系统监测阐明流行毒株的遗传进化规律,对于指导疫苗毒株的筛选和提高临床免疫防控的效果具有重要的意义。本研究对江苏省及周边地区2016-2018年间规模化鸡场H9N2亚型AIV的感染和发病情况进行了跟踪监测,对发病鸡群进行病原分离和鉴定,对分离毒株进行系统的遗传进化分析和抗原性差异比较分析,以期为本地区鸡感染H9亚型AIV的防控提供参考。1、发病鸡群H9N2亚型AIV分离鉴定与遗传进化分析监测期内共分离鉴定到53株H9N2亚型AIV流行毒株,对所有分离株进行血凝素(HA)基因测序和遗传进化分析,从构建的系统发育进化树上可以看出所有分离株均属于A/chicken/Beijing/1/1994-like代表的h9.4.2亚系,且所有分离株在系统发育进化树上分布比较集中,均属于h9.4.2.5亚系,但是也可以进一步细分为不同的小进化分支。根据HA基因序列推导的所有毒株HA蛋白的裂解位点氨基酸序列全部为RSSR,符合典型的LPAIV裂解位点序列特征。大部分分离株的HA蛋白在第203位氨基酸处发生了突变,由T变为I/V,使得第200位糖基化位点缺失,第297位氨基酸位点处发生突变,由P变为S,从而在295位处多了一个潜在的糖基化位点NCS。新的糖基化位点的出现或者原有糖基化位点的缺失都有可能造成病毒毒力以及抗原性的改变。大多数分离株在第234位受体结合位点均由Q变为L,该位点的突变已被证明可增加病毒感染哺乳动物的可能性。2、不同进化分支H9N2亚型AIV分离株抗原性差异研究为了进一步确定同一亚系下面不同的细小进化分支上的毒株在抗原性上是否存在差异,又进一步根据绘制的系统发育进化树,在h9.4.2.5亚系分支中选取了 7个不同细小进化分支上的病毒株,分别是 Ck/JS/YZ0418/2016、Ck/JS/TZ0218/2017、Ck/JS/YZ0725/2017、Ck/JS/YZ-HJ0510/2017、Ck/JS/YZ-GL0916/2016、Ck/JS/YZ-GY 1024/2017 和Ck/JS/YZ-GY0822/2017,进行了抗原性差异比较分析。试验一将160只1日龄健康海兰褐母雏随机分为8组,每组20只,用上述7个毒株分别制备成油乳剂灭活苗,其中7组鸡分别在7日龄和35日龄时分别用上述灭活疫苗进行免疫,每只鸡肌肉注射0.5 mL疫苗,另一组作为非免疫对照组。分别在30日龄、60日龄、100日龄和127日龄采血分离血清,并用分离株Ck/JS/NT0428/2018制备的血凝抗原分别测定HI抗体水平。结果显示,这7个病毒株都有良好的免疫原性,但用同一种抗原测定的HI抗体效价存在显著的差异,反映出相互之间可能存在一定的抗原差异性。试验二根据交叉免疫抗体检测结果进一步选择了不同小进化分支上差异显著的4个病毒株进行了交叉免疫攻毒保护试验,分别是Ck/JS/YZ0418/2016、Ck/JS/TZ0218/2017、Ck/JS/YZ-GY1024/2017 和 Ck/JS/YZ-GY0822/2017。将50只7日龄的SPF鸡随机分为5组,每组10只;前4组分别免疫以上述4个毒株制备的油乳剂灭活疫苗,最后一组作为非免疫对照组。免疫后21天用分离株Ck/JS/NT0428/2018进行攻毒,攻毒剂量为1082EID50/只。攻毒后每日观察鸡群临床表现,结果显示,免疫组的鸡临床表现正常,对照组部分鸡有一过性食欲不振等现象。分别在攻毒后第3、6、9天采集每组鸡的咽拭子和泄殖腔拭子,应用实时荧光定量PCR定量检测排毒情况。结果表明,4种疫苗免疫均能显著降低排毒水平,但组间存在较为显著的差异,同一进化分支的病毒对应的疫苗免疫组排毒保护效果最佳。综上所述,本研究的结果显示所有分离株都同属于h9.4.2.5亚系分支,但处在不同细小分支的病毒株的抗原性差异明显。