论文部分内容阅读
目的探讨体外培养的成纤维细胞（Fibroblast FB）热损伤变性后形态,功能的变化规律及HSP90的表达。方法采用体外组织细胞培养技术培养离体人真皮成纤维细胞,选择52℃浴水加热30S作为实验组,37℃30S为对照组,于3h,6h,12h,24h,36h,48h,72h,96h,120h,168h,240h等不同时相点分别采用MTT法,倒置显微镜,透射电镜,流式细胞仪,反向高效液相仪,乳酸脱氢酶（Lactic Acid Dehydrogenase,LDH）试剂盒,Na+-K+-ATP酶试剂盒,Ⅰ型胶原和碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）ELASA Kit,RT-PCR,免疫荧光及Western blot等技术对上述两组细胞的存活,形态,细胞膜通透性,Na+-K+-ATP酶,FGF2的分泌,Ⅰ型胶原的转录,分泌及HSP90的合成等进行检测。结果实验组成纤维细胞生存率为50%,显著低于对照组（P＜0.05）,电镜显示实验组细胞3h细胞膜,线粒体,内质网有明显损伤,透明样物,髓鞘样物增多,24h达到顶峰,细胞核形态始终未见明显异常,72h（3天）后成纤维细胞开始逐渐恢复,168h（7天）细胞形态基本恢复正常。流式细胞仪提示细胞滞留S期（S为21.13%）,明显高于对照组（S为14.29%,P＜0.01）;实验组细胞凋亡率（3.59%）也明显高于对照组（0.12%）（P＜0.01）。实验组细胞3h细胞膜LDH漏出率为1057.90±243.61U/L,显著高于对照组646.08±248.98 U/L（P＜0.05）,24hLDH漏出率达到高峰（实验组:1493.88±80.723 U/L,对照组:62150±228.82 U/L,P＜0.01）,72h后基本恢复正常。实验组胞膜中3h Na+—K+—ATP酶的活性为1.40±0.04 U/L,低于对照组1.49±0.04U/L（P＜0.05,为正常活性的95.3‰）,24h实验组Na+-K+-ATP酶的活性为0.30±0.02 U/L,低于对照组0.49±0.06 U/L（P＜0.05,为正常活性的61.2‰）,48h后基本恢复正常。实验组3h细胞线粒体ATP量为345439.4±33954.24μg/ml,低于对照组435416.4±23613.27μg/ml（实验组ATP量为对照组的79‰,P＜0.05）,24h实验组细胞线粒体ATP量进一步降低为94731.00±1082.12μg/ml,明显低于对照组215604.2±20610.17μg/ml（实验组ATP量为对照组的43.94‰,P＜0.05）。实验组24h,168h,240h的细胞外FGF2量与对照组无差异（P＞0.05）,48h,72h,96h,120h比对照组低（P＜0.05）且它们之间相对稳定（P＞0.05）.24h,72h,120h,168h,240h实验组细胞Ⅰ型胶原的转录,分泌与对照组无差别（P＞0.05）。用免疫荧光观察到FB热损伤后24h胞浆,胞核中HSP90高表达。Western blot显示3h即有HSP90表达量升高,24h达到高峰,维持到96h以上,120h恢复到正常。结论FB热损伤变性后形态改变,代谢障碍,功能降低,其功能于48h-120h（2-5天）逐渐恢复,7天基本恢复正常的形态,功能,HSP90对FB热损伤变性具有保护作用。