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背景:弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生的人兽共患病原体,能够感染包括哺乳动物和鸟类在内的各种温血宿主。弓形虫的感染在各地区之间的流行率很高,地理范围几乎遍及全球。全球大约16–40%人被弓形虫感染。孕期弓形虫急性感染可引起先天性缺陷,例如脑积水、癫痫甚至死产。慢性感染是进行性失明的重要原因,并可能导致免疫功能低下的患者出现神经系统疾病。当前缺乏有效预防弓形虫感染的措施,因此,迫切需要开发新型疫苗。钙依赖性蛋白激酶(CDPK)主要存在于植物、绿藻和顶复门原虫的钙信号传导中,但不存在于哺乳动物或真菌中,属于丝氨酸/苏氨酸激酶的超家族,在对宿主细胞侵袭、滑行运动、逸出和其他一些发育过程中发挥重要作用。其中弓形虫CDPK3(TgCDPK3)被认为是关键的毒力因子。基于CDPK3的这些特性,本研究将制备重组弓形虫CDPK3蛋白(rTgCDPK3),用纯化的rTgCDPK3蛋白去免疫BALB/c小鼠评估该蛋白作为疫苗的可能性,为弓形虫病的预防和疫苗的研制提供实验依据。目的:探究弓形虫钙依赖性蛋白激酶3(TgCDPK3)蛋白作为弓形虫病候选疫苗的可能性,为弓形虫病的预防和疫苗的研制提供实验依据。方法:采用生物信息软件分析TgCDPK3的生物化学性质,预测TgCDPK3用作疫苗的可能性。在大肠杆菌BL21中转入p ET28a-TgCDPK3重组质粒诱导rTgCDPK3蛋白的表达,通过Coomassie brilliant blue R-250染色以及免疫印迹实验鉴定纯化的rTgCDPK3蛋白。购买210只适龄的雌性BALB/c小鼠,随机分为6组,分别为空白组、PBS组、2.5μg、5.0μg、10.0μg和20.0μg。利用超声、Ni树脂纯化等试验方法将rTgCDPK3蛋白纯化,再用佐剂乳化纯化后的蛋白。每隔两周通过大腿肌肉注射乳化后的蛋白去免疫小鼠,整个实验需要免疫三次。留取每次免疫后小鼠的血清,通过ELISA检测血清特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a的水平。最后一次免疫后取小鼠脾淋巴细胞培养,并用rTgCDPK3蛋白进行刺激培养,通过CCK8试验检测淋巴细胞增殖情况,同时收集培养液上清,用ELISA检测上清中IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-10的表达。在最后一次免疫后2周,每组随机挑选20只小鼠腹腔注射1×103 RH的速殖子,记录小鼠在30天内的存活时间,并计算其存活率。为了检测免疫小鼠抗慢性弓形虫感染的能力,每组随机挑选6只小鼠经灌胃感染20个PRU的组织包囊。感染后2个月,计算对照组和免疫鼠中脑组织包囊数并且观察组织包囊的大小。结果:(1)生物信息软件DNAStar分析预测:分析结果表明TgCDPK3蛋白不仅具有理想的表面抗原和抗原指数,而且还具有多个B细胞表位,亲水性和柔性较好,表明其具有成为弓形虫候选疫苗的良好前景。(2)考马斯亮蓝染色与Western blotting检测:通过考马斯亮蓝染色发现在预期位置59KDa处有一个特异性的条带,通过Western blotting检测表明兔的多克隆CDPK3抗体只能在TgCDPK3蛋白对应的位置产生特异性识别而对另一种纯化的重组Tg ROP18蛋白不能识别,证明成功诱导和表达rTgCDPK3蛋白。(3)小鼠血清特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a的检测:ELISA结果显示rTgCDPK3免疫小鼠血清中IgG、IgG1和IgG2a水平明显比空白组和PBS组高(p<0.001),并且随着小鼠免疫次数的增加IgG、IgG1和IgG2a的水平逐渐增加。其中10μg rTgCDPK3免疫组免疫效果最佳。另外,IgG2a水平明显高于IgG1,表明rTgCDPK3诱导了以Th1为主的免疫应答。(4)小鼠脾细胞增殖实验:CCK8试验结果表明rTgCDPK3免疫的小鼠具有明显的脾细胞增殖反应,两个对照组说明PBS对免疫小鼠无影响。(5)细胞因子的检测:在免疫小鼠的脾细胞中IFN-γ分泌明显增加(p<0.001),IL-2、IL-4和IL-10水平在不同组之间没有明显变化。(6)rTgCDPK3免疫小鼠的保护性:空白组小鼠感染RH速殖子后均在9天内死亡,rTgCDPK3免疫小鼠存活时间显著延长,并且各免疫组的脑包囊计数显著减少(p<0.001)。结论:我们的研究表明,rTgCDPK3蛋白成功激活了以Th1型细胞免疫应答为主的特异性免疫反应,并且接种rTgCDPK3蛋白的BALB/c小鼠能够抵抗急性和慢性弓形虫感染,这表明重组rTgCDPK3蛋白是抗弓形虫疫苗开发的潜在候选者。