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泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome,UPS)是真核生物体内的蛋白质降解途径,由泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3以及26S蛋白酶体复合物四个部分实现。植物泛素连接酶E3主要包括四种类型:细胞分裂后期复合体型、HECT型、SCF型和RING/U-box型。其中,植物U-box蛋白简称为PUB(plant U-boxprotein)。拟南芥中已报道至少存在64个PUB基因成员,有研究表明拟南芥PUBs(AtPUBs)家族成员在植物逆境响应中发挥重要功能,且不少家族成员之间存在功能互补或冗余的现象。AtPUB10是AtPUBs家族中的一员,通过介导bHLH家族MYC2转录因子的泛素化降解抑制茉莉酸途径、负调控脱落酸途径,然而缺乏pub10突变体对植物病原菌的响应,以及与AtPUB10高度同源的AtPUB11是否参与调控植物病原菌响应的研究。
为了分析拟南芥E3泛素连接酶PUB10、PUB11对植物病原菌响应的影响,我们首先对AtPUB10、AtPUB11进行生物信息学分析,分析它们之间的亲缘关系以及同源性。从前提构建的遗传学突变体材料中,鉴定拟南芥pub10/pub11双突变体,并从PstDC3000侵染、病原菌引起植物突变体MAPK的变化、flg22刺激拟南芥叶片ROS释放量以及定量免疫基因的表达水平等方面着手,探究AtPUB10、AtPUB11在抵抗PstDC3000的调控作用。获得如下结果和结论:
(1)通过生物信息学分析,发现构建的AtPUBs家族进化树AtPUB10、AtPUB11聚类在一起,两者蛋白氨基酸序列比对相似性达到75.44%,基因启动子都有多种光响应元件、激素响应元件以及防御和胁迫响应元件等,二级结构都主要由α-螺旋和无规卷曲构成,并且三级结构非常相似,说明两者有非常近的亲缘关系以及同源性,在拟南芥体内具有相似的生物学功能。
(2)采用三引物法及表达量验证等方法成功鉴定并获得pub10/pub11双突变体;构建AtPUB10基因分段表达的pGEX4t-1载体,表达、纯化了PUB10分段蛋白;通过GST-PUB10-ARM分段蛋白免疫小鼠获得PUB10抗体,为后续AtPUB10、AtPUB11的生化功能研究打下基础。
(3)通过植物抵抗病原菌的实验,发现pub10/pub11双突变体对PstDC3000更敏感,进一步分析AtPUB10、AtPUB11的缺失对植物免疫的影响,发现pub10/pub11双突变体在PstDC3000处理后MAPK磷酸化水平在10-20min间快速下降,flg22刺激后ROS释放量降低,且JA响应基因与免疫负调控基因表达量上升明显,说明AtPUB10、AtPUB11在抵抗PstDC3000具有正调控作用。
综上所述,本论文的研究结果表明AtPUB10、AtPUB11在拟南芥体内具有相似的生物学功能,能够利用大肠杆菌系统在体外分段表达,抵抗PstDC3000病原菌的过程具有正调控作用,并存在功能冗余。
为了分析拟南芥E3泛素连接酶PUB10、PUB11对植物病原菌响应的影响,我们首先对AtPUB10、AtPUB11进行生物信息学分析,分析它们之间的亲缘关系以及同源性。从前提构建的遗传学突变体材料中,鉴定拟南芥pub10/pub11双突变体,并从PstDC3000侵染、病原菌引起植物突变体MAPK的变化、flg22刺激拟南芥叶片ROS释放量以及定量免疫基因的表达水平等方面着手,探究AtPUB10、AtPUB11在抵抗PstDC3000的调控作用。获得如下结果和结论:
(1)通过生物信息学分析,发现构建的AtPUBs家族进化树AtPUB10、AtPUB11聚类在一起,两者蛋白氨基酸序列比对相似性达到75.44%,基因启动子都有多种光响应元件、激素响应元件以及防御和胁迫响应元件等,二级结构都主要由α-螺旋和无规卷曲构成,并且三级结构非常相似,说明两者有非常近的亲缘关系以及同源性,在拟南芥体内具有相似的生物学功能。
(2)采用三引物法及表达量验证等方法成功鉴定并获得pub10/pub11双突变体;构建AtPUB10基因分段表达的pGEX4t-1载体,表达、纯化了PUB10分段蛋白;通过GST-PUB10-ARM分段蛋白免疫小鼠获得PUB10抗体,为后续AtPUB10、AtPUB11的生化功能研究打下基础。
(3)通过植物抵抗病原菌的实验,发现pub10/pub11双突变体对PstDC3000更敏感,进一步分析AtPUB10、AtPUB11的缺失对植物免疫的影响,发现pub10/pub11双突变体在PstDC3000处理后MAPK磷酸化水平在10-20min间快速下降,flg22刺激后ROS释放量降低,且JA响应基因与免疫负调控基因表达量上升明显,说明AtPUB10、AtPUB11在抵抗PstDC3000具有正调控作用。
综上所述,本论文的研究结果表明AtPUB10、AtPUB11在拟南芥体内具有相似的生物学功能,能够利用大肠杆菌系统在体外分段表达,抵抗PstDC3000病原菌的过程具有正调控作用,并存在功能冗余。