心室重构（Ventricular remodeling）是各种器质性心脏病向心力衰竭发展的共同通路,心室重构这一病理生理过程一经启动进行性恶化,它贯穿心力衰竭发展的始终。其特征改变是心脏几何结构异常,心肌细胞肥大伴随功能异常、数量减少,心脏间质细胞增加,伴随心脏功能下降。高血压、冠心病、心肌病、瓣膜病、应激反应及化学药品等均会导致心室重构发生。其中高血压,冠心病是最常见原因,心室重构是高血压、冠心病病情恶化进展的重要因素,抑制心室重构是抑制心功能进行性下降,改善患者预后的关键因素。关于心室重构的基础和临床研究很多,但仍没有完全阐明心室重构发生发展的机制,虽然治疗手段很多,但仍没有一种确切治疗手段能够抑制逆转心室重构。可见这一病理生理过程本身极其复杂,理化因素、病理刺激、自身免疫、炎症反应等等因素均可诱发心室重构。如何合理用药抑制心室重构,延缓心衰进展,最大限度改善预后,有着重大临床意义和社会效益。水通道蛋白（Aquaporins,AQPs）自发现至今已有30年,共发现13种AQPs（AQP0^AQP12）表达于哺乳动物细胞膜上,它们的作用是负责水分子跨膜转运,在渗透压梯度作用下协调水分子的跨细胞膜转运。研究发现,在人类和鼠心肌组织中,AQPS家族中AQP1表达最多,主要表达于血管内皮细胞和心肌细胞膜上,在生理作用下,介导水的跨膜转运,维持组织细胞间水的平衡。病理状态下,如发生心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI）后,AQP1异常表达将引起心肌细胞水肿,并且会导致微血管通透性增加,发生MI/RI,病变区域心肌组织的血供减少或消失,进而引发心脏氧供不足,心肌能量获取不足,有毒代谢产物释放增加,导致心肌细胞功能异常。在缺血再灌注早期,由于是缺血缺氧代谢异常所致的大量细胞因子、炎症介质释放,导致微血管通透性增加,水外渗至组织间引起水肿。由于供氧不足代谢异常使得局部乳酸堆积,产生细胞毒副效应,影响细胞膜通透性使得心肌细胞水肿。一项关于烧伤所致大鼠心肌水肿的研究中发现,烧伤导致大鼠心肌组织明显水肿,此外通过检测发现大鼠心肌组织中AQP1蛋白表达也明显增多,研究发现心肌水肿程度与AQP1蛋白表达呈正相关,说明AQP1可能参与介导了烧伤后心肌组织缺血缺氧性所致心肌水肿的病理进程。心肌水肿这一病理现象本身对心肌组织存在巨大影响,水肿压迫会导致微循环异常,影响组织供血供氧,二者相互作用形成恶性循环,除此以外,它会影响心室舒张收缩功能。而心肌水肿会导致电传导异常,引发恶性心律失常,增加死亡率。心肌水肿还会引发心肌纤维化引起心肌结构改变导致心室重构。另外有研究显示,汞离子(Hg²⁺)通过抑制AQPs来降低细胞水肿减少线粒体膜,抑制凋亡,表明AQPs在细胞凋亡中起到一定作用。此外,多个研究发现通过下调AQP1表达,可减轻细胞水肿,减少细胞凋亡,但未见到AQP1关于心肌细胞凋亡的相关报道。本研究拟就AQP1在病理状态下心肌组织中表达情况来探讨其对心室重构的影响。本研究关键点是寻找一种切实可行的AQP1抑制剂,已经有大量关于调节AQP1蛋白表达的研究,这些研究涉及到的影响因素包括高渗环境、低氧状态、激素水平、磷酸化诱导、汞离子、乙酰唑胺、RNA干扰因子等等,以上诸多因素,要么操作困难,要么存在毒副作用,很难用于临床治疗,碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺（Acetazolamide,AZA）是一个老药,在临床中用于多种疾病,因其能抑制AQP1表达,推测在治疗缺血再灌注损伤方面有其潜在推广和应用价值。曾有关于肾脏组织的研究发现它可抑制AQP1的水转运,可降低肾小管水通透性。在雪旺细胞体外培养的研究中也发现加入AZA后,低氧所诱导AQP1转录与表达受到明显抑制,说明AZA能显著抑制AQP1表达。还有关于AZA的研究表明它能可逆性抑制爪蟾卵母细胞AQP1的通透性,并能够降低瘤组织中AQPl的表达减少肿瘤侵袭转移。但AZA对心肌细胞AQP1表达影响未见报道。以前大量关于炎症因子的研究发现,许多心脏疾病均会导致肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-a,TNF-α）,白介素-6（interleukin-6,IL-6）等炎性细胞因子表达增加,这些因子在疾病发生转归的病理过程中起到重要作用,炎症反应能够加速心肌肥大引起心室重构。IL-6干预的心肌细胞可导致心肌细胞蛋白质合成增多,一些导致心肌肥厚的蛋白因子表达也会增加,如P-肌球蛋白重链(（P-myosin heavy chain,P-MHC）。研究发现,TNF-α升高不仅导致心肌细胞肥大,远期观察发现其具有较高的心衰率和死亡率。众多研究均发现,心肌细胞作为TNF-α作用的靶细胞,高浓度TNF-α可导致心肌细胞肥大引起心室重构。另外,研究表明IL-6、TNF-α还影响心肌收缩舒张功能。目前无关于AQP1与炎症因子相关性的研究。P38是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）家族重要一员,是机体内的一条重要的炎症信号介导通路,参与多种炎症反应并促使细胞凋亡,其参与心、脑、肾的缺血再灌注损伤的发生,除介导炎症反应外,研究表明,前列腺癌细胞在缺氧条件下AQP1表达水平与P38MAPK活化程度相关。另有关于胸膜间皮细胞的研究发现,应用肽聚糖抑制P38MAPK活化,可以抑制缺氧所诱导的AQP1的表达升高。心肌细胞中AQP1表达与P38MAPK是否相关尚无报道。虽然关于AQP1的研究很多,但对于其在心肌中表达规律以及其对心室重构的影响鲜有报道。本研究主要观察心肌在缺血和压力超负荷情况下AQP1表达情况,并选取AZA为干预手段,研究它对心肌组织中AQP1表达的影响,观察这一治疗手段对心脏含水量、心脏重量、细胞凋亡、心脏超声指标的影响,从而探讨AZA能否有效抑制心室重构。另外同时观察心肌组织中IL-6,TNF-α水平,以及P-P38MAPK表达情况,以期进一步研究早期心室重构的病理过程,探讨在心室重构中这几者之间的相互作用,为心室重构治疗提供进一步理论依据。本研究分为四部分进行:第一部分AQP1在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的表达规律及作用。第二部分AZA通过降低AQP1转录与表达抑制小鼠心肌缺血再灌注损伤所致的早期心室重构。第三部分AQP-1在小鼠压力超负荷模型中的表达规律及作用。第四部分AZA通过降低AQP1转录与表达抑制小鼠压力超负荷所致的早期心室重构。第一部分AQP1在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的表达规律及作用目的:探讨缺血条件下AQP1表达水平、炎症因子IL-6、TNF-α水平以及P38MAPK磷酸化水平,以及几者之间的相关关系,并观察心肌水肿情况,并探讨AQP1过表达与心肌水肿发生与持续的关系。进而为如何预防缺血再灌注后心肌水肿,保护受损心肌提供研究方向。方法:为检测IL-6,TNF-α,P-P38 MAPK,AQP1在小鼠MI/RI后的表达水平及规律,将80只小鼠随机分为以下2组,A组:假手术组:按照MI/RI造模方法开胸手术,只穿线不结扎前降支。B组按照MI/RI造模方法,结扎冠脉前降支30分钟。两组分别于4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、5天、7天、14天等时间点行实验动物取材,以颈椎脱臼处死小鼠,迅速打开胸腔,取出心脏,用4℃预冷生理盐水冲洗,组织匀浆检测心肌组织IL-6,TNFα水平,Western Blot检测P-P38 MAPK、AQP1相对蛋白表达,干湿重法测心肌组织水含量。结果:小鼠手术结扎前降支后,可见缺血相关改变。在各时间点观察心脏外形,在48小时后MI/RI组心脏较非手术组明显增大,考虑由于心肌缺血再灌注所致心室重构可能性大。MI/RI小鼠各时间点AQP1蛋白表达量均明显高于假手术组,从术后4小时至24小时呈轻度下降趋势,自术后24小时至术后1周表达量呈急剧增加趋势,至术后1周达到高峰。MI/RI组小鼠心肌组织中IL-6、TNF-α水平在各时间点均明显高于对照组,从术后4小时开始升高,24小时达到峰值,此后浓度逐渐下降,但在1周前都处于较高水平。MI/RI组在各个时间点P-P38 MAPK蛋白表达量均明显高于假手术组,从术后4小时开始升高,48小时达到峰值,此后蛋白表达量逐渐下降。MI/RI组小鼠各时间点左室心肌水含量均高于对照组,术后4小时开始增加至12小时达峰,后开始下降至48小时降至最低,自术后48小时开始心肌含水量再次增加,至术后5天达最高峰,至术后1周都维持在一个较高水平,后呈下降趋势。AQP1与P-P38 MAPK表达量存在相关性。P-P38 MAPK蛋白相对表达量与TNF-α存在相关性。48小时前各时间点左室心肌水含量与IL-6、TNF-α相关。48小时以后左室心肌水含量与AQP1密切相关性。结论:缺血再灌注损伤可导致心肌水肿,心室重构,心脏外形几何结构改变,导致心室腔体积明显增大。缺血再灌注损伤导致AQP1表达量明显升高,其表达水平与小鼠心肌组织含水量密切相关,尤其是48小时后与心肌组织含水量相关性更加明显。缺血再灌注损伤早期心肌组织中IL-6、TNF-α明显升高,并与早期心肌水肿密切相关,IL-6、TNF-α是介导心室早期重构的重要因素之一。小鼠心肌AQP1蛋白表达与P38MAPK磷酸化密切相关。TNF-α水平与P-P38MAPK表达具有相关性。第二部分AZA通过降低AQP1表达抑制小鼠心肌缺血再灌注损伤所致的早期心室重构目的:探讨AZA干预是否能够改善心肌缺血再灌注所导致的早期心室重构,并探讨AZA是通过何种途径起到影响早期心室重构的作用。方法:40只C57BL/6小鼠随机分为四组,每组各10只:假手术组（sham组）,假手术+乙酰唑胺组（sham+AZA组）,缺血再灌注损伤组（MI/RI组）:缺血再灌注损伤+乙酰唑胺组（MI/RI+AZA组）。于手术后1周,乙醚麻醉小鼠后超声心动图检测心脏结构大小及心功能情况,然后,颈椎脱臼处死小鼠,取出心脏,计算心重/体重比（HW/BW）,取部分缺血部位心肌组织行切片染色,观察细胞形态及凋亡情况,另取部分心肌组织进行匀浆后查心肌组织炎性因子表达水平,RT-PCR和Western blot分别检测AQP1的mRNA和蛋白表达,Western blot检测P-P38MAPK的蛋白表达,干湿重法计算心肌水含量。结果:与对照组组比较,MI/RI组心脏体积明显增大,室腔扩大。HE染色,MI/RI组心肌细胞水肿明显,结构破坏,心肌纤维紊乱、间隙增宽,可见大量炎症细胞浸润。AZA干预能够降低心脏扩大,减少心肌细胞水肿,结构破坏,以及炎症细胞浸润。TUNEI染色,MI/RI组心肌细胞凋亡率明显高于对照组,AZA干预能明显降低MI/RI诱导的细胞凋亡。MI/RI组AQP1蛋白相对表达量和mRNA的相对表达量显著高于对照组。AZA干预能够降低MI/RI小鼠心肌组织AQP-1蛋白及mRNA的表达。MI/RI组心肌组织中IL-6、TNF-α水平均明显高于对照组AZA干预能够降低MI/RI小鼠心肌组织中IL-6、TNF-α水平。MI/RI组P-P38 MAPK蛋白相对表达量显著高于对照组。AZA干预能够降低MI/RI小鼠心肌组织P-P38 MAPK蛋白的相对表达量。MI/RI组心肌组织水含量,心脏重量/体重（HW/BW）比值均明显高于对照组。AZA治疗能够降低MI/RI小鼠心肌组织水含量、HW/BW值。MI/RI组IVSD、LVAWD以及IVSS均明显厚于对照组,LVAWS要薄于对照组,LVEDD和LVESD明显大于对照组、LVEF低于对照组AZA干预能够改善MI/RI所致的LVEF降低,以及MI/RI所致LVEDD、LVESD变大以及LVAWD增厚,但对IVSD,IVSS,以及LVAWS改变无显著影响。结论:缺血再灌注损伤可导致心肌细胞水肿,结构破坏,细胞凋亡、心脏体积增大,心室重构;导致AQP1转录与表达增加,进而引起心肌细胞水肿、细胞凋亡增加,心肌组织水含量以及HW/BW比值增加,并导致左心室体积扩大,心脏功能下降,发生心室重构。AZA干预能够明显降低AQP1的转录与表达,减轻心肌细胞水肿,减少细胞凋亡,降低心肌水含量,减少心脏体积质量,改善心脏结构及功能作用,抑制心室重构,但对心肌肥厚影响不明显。AZA干预能够降低MI/RI所致的P-P38MAPK蛋白的表达增高。AZA干预还降低了MI/RI所致心肌组织中IL-6、TNF-α水平升高,进而可能起到减少细胞凋亡,延缓心室重构的作用。第三部分AQP-1在小鼠压力超负荷模型中的表达规律及作用目的通过观察不同时间点压力超负荷小鼠IL-6,TNF-α,P-P38MAPK,AQP1表达水平,以及各时间点心肌含水量,来探讨心肌压力超负荷条件下AQP1过表达与心肌水肿的相关性,以及与炎症因子IL-6,TNF-α水平、P38-MAPK磷酸化水平的相关性。方法将80只小鼠随机分为以下2组,A组:假手术组（sham组）:按照造模方法开胸手术,只穿线不结扎主动脉弓。B组主动脉弓缩窄术组（TAC组）按照主动脉弓缩窄术造模,部分结扎主动脉弓。两组分别于4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、5天、7天、14天等时间点行实验动物取材,以颈椎脱臼处死小鼠,迅速打开胸腔,取出心脏,用4℃预冷生理盐水冲洗,组织匀浆检测心肌组织IL-6,TNFα水平,Western Blot检测P-P38 MAPK、AQP1相对蛋白表达,干湿重法测心肌组织水含量。结果心肌压力超负荷导致心肌损伤心室重构。TAC组小鼠心肌组织中IL-6、TNF-α水平在各时间点均明显高于对照组。sham组AQP1表达在各时间点比较恒定,各时间点间差异无统计学意义。TAC组小鼠AQP1蛋白表达量从术后4小时开始明显增加,至术后72小时达到高峰,后有所下降,至术后14天仍在一个较高水平。与sham组比较,TAC组各时间点AQP1蛋白表达量均显著升高。TAC组小鼠P-P38 MAPK蛋白表达量从术后4小时开始明显增加,至术后48小时达到高峰,后有所下降,至术后14天仍在一个较高水平。与sham组比较,TAC组各时间点P-P38MAPK蛋白表达量均显著升高。sham组左室心肌水含量在各时间点比较恒定,各时间点间水含量差异无统计学意义。TAC组小鼠左室心肌水含量从术后4小时开始增加至5d达峰,后开始稍有下降至术后14天仍在较高水平。结论压力超负荷可导致心肌水肿,心室重构,心脏外形几何结构改变,导致心脏体积明显增大。压力超负荷导致AQP1表达水平明显升高,并与小鼠心肌组织含水量密切相关。压力超负荷导致心肌组织中IL-6、TNF-α明显升高,并与心肌水肿相关。P38MAPK磷酸化水平与小鼠心肌AQP1蛋白表达具有相关性。第四部分AZA通过降低AQP1表达抑制小鼠压力超负荷所致的早期心室重构目的:探讨压力超负荷对小鼠心肌细胞肥大,心肌水肿、心肌细胞凋亡以及心室重构的影响,并分析AQP1在其中起到的作用,AZA干预是否能够改善上述指标。方法:40只C57BL/6小鼠随机分为四组,每组各10只:假手术组,假手术+乙酰唑胺组,主动脉弓缩窄术（TAC）组,主动脉弓缩窄术+乙酰唑胺（TAC+AZA）组。于手术后2周,乙醚麻醉小鼠后超声心动图检测心脏结构大小及心功能情况。颈椎脱臼处死小鼠,取出心脏,计算心重/体重比（HW/BW）,取部分缺血部位心肌组织行切片染色观察细胞形态及凋亡情况,另取部分心肌组织进行匀浆后查心肌组织炎性因子表达水平,Western blot检测P-P38 KMAP的蛋白表达,RT-PCR和Western blot分别检测AQP1的mRNA和蛋白表达,干湿重法计算心肌水含量。结果:与对照组相比,TAC模型组小鼠心脏体积增大,几何形状改变,左心室腔扩大;HE染色肌细胞水肿、肥大、形态不规则,细胞间隙增大;AZA干预能够减少心肌细胞水肿、肥大,降低细胞结构破坏,抑制心脏扩大;TUNEI染色可见,TAC组心肌细胞凋亡率明显高于对照组;AZA干预能明显降低TAC诱导的细胞凋亡;TAC组AQP1 mRNA和蛋白相对表达量显著增高,AZA干预能够降低TAC小鼠心肌组织AQP-1 mRNA及蛋白的表达;TAC组心肌组织中IL-6、TNF-α水平均明显升高;AZA干预能够降低TAC诱导的IL-6、TNF-α升高;TAC组P-P38 MAPK蛋白相对表达量显著增高;AZA干预能够降低TAC小鼠心肌组织P-P38 MAPK蛋白的相对表达量,TAC组心脏重量/体重（HW/BW）,心肌组织水含量均明显升高,AZA治疗能够降低TAC小鼠心肌组织水含量、HW/BW值。与对照组比较,TAC组IVSD、IVSS及LVPWD均明显增厚,而LVEDD明显降低,LVEF明显降低,AZA治疗的TAC组小鼠LVEF明显改善,对于TAC所致的IVSD、IVSS、LVPWD和LVEDD改变没见明显影响。结论:压力超负荷可导致心肌细胞水肿,肥大,结构破坏,心脏体积增大,心室腔几何结构改变,导致心室重构;导致AQP1转录与表达增加,进而引起心肌细胞水肿、细胞凋亡增加,心肌组织水含量以及HW/BW比值增加,并导致左心室体积扩大,心脏功能下降;AZA干预能够明显降低AQP1的转录与表达,减轻心肌细胞水肿,减少细胞凋亡,降低心肌水含量,减少心脏体积质量,改善心脏功能作用。AZA干预能够降低P-P38MAPK蛋白的表达增高。AZA干预还降低了压力超负荷所致的心肌组织中IL-6、TNF-α水平升高,降低炎症反应,进而可能起到减少细胞凋亡,进而达到改善心功能的作用。