表观遗传修饰在创造多样性以及保持特定细胞表现型和活性方面扮演着极其重要的角色,并且,对于DNA和染色体的结构稳定性来说也是举足轻重的。DNA甲基化是哺乳动物基因组中最为常见也是最为重要的表观遗传修饰方式之一,是生物体表观遗传的一种调节过程。DNA甲基化基于甲基化的核苷酸种类及甲基化的位置被分为三类,即腺嘌呤的N6上的甲基化,胞嘧啶N4位上的甲基化和胞嘧啶C5上的甲基化。所有已知的DNA甲基转移酶在甲基化过程中都是将S-腺苷甲硫氨酸作为甲基的供体。目前,越来越多的证据表明DNA甲基转移酶活性与人体健康息息相关,异常的DNA甲基转移酶活性与各种身体机能紊乱和疾病密切相关,例如癌症。因此,了解和定量分析DNA甲基转移酶活性同时深入理解DNA甲基化在不同细胞中的模式对于人类健康的研究十分有利。所以,检测DNA甲基转移酶活性最终将会运用于临床应用,并且有望成为预后症状的工具。鉴于此,本论文利用熵驱动的无酶扩增对DNA甲基化过程以及DNA甲基转移酶的活性进行实时监测,同时高通量筛选了 DNA甲基转移酶的抑制剂;接着利用甲基化的胞嘧啶能够增强鸟嘌呤四链体脱氧核酶(G4-DNAzyme)的催化活性,发展了一种新颖简便的检测DNA甲基转移酶活性的方法。具体如下:1.DNA甲基转移酶能催化DNA特定序列发生甲基化,基于该功能我们通过熵驱动立足点介导的发卡取代扩增(ETHDA)构建了一个简易且灵敏的一步法荧光传感平台来检测DNA甲基化过程。在本体系中,发卡探针被DNA腺嘌呤甲基转移酶(DamMTase)甲基化之后再由DpnI限制性内切酶剪切该甲基化位点,释放催化链,启动接下来的信号放大过程。体系中的荧光信号强度随着ETHDA过程的进行而增大。这种新型的检测方法无需复杂的操作过程,避免了扩增中加入其他扩增酶参与反应。实验结果显示,该方法拥有较高的灵敏度和选择性,检测限低至0.01 U· mL-1,线性范围为0.01-100 U·L-1,因此,该方法可以在实时监控DNA甲基化程度以及在临床检测和生物医药领域筛选抑制剂应用方面发挥着重要作用。2.我们发现G4-DNAzyme的3’端胞嘧啶甲基化后能提高DNAzyme活性。利用互补双链杂交策略,将DNAzyme序列封闭从而使其无法形成鸟嘌呤四链体(G4)结构,而当加入取代链后,使得富鸟嘌呤序列释放出来,形成活性G4-DNAzyme结构。处于自由状态的DNA酶序列自发地形成G4结构与hemin结合后获得类似过氧化物酶的活性。最终,在双氧水存在的情况下将ABTS2-催化氧化成有颜色的产物ABTS·-。当长链DNA与互补链形成的双链中的特定DNA位点被CpG甲基化酶M.SssI甲基化之后,催化H202氧化ABTS2-的显色反应能够更快更有效的发生。本方法检测限为0.1 U·mL-1,线性范围为0.1-100 U· mL-1。由此可见,该检测方法操作简便,无需标记,同时还能将DNA甲基转移酶活性实现可视化,为将诊断DNA甲基转移酶活性与临床相关的性状结合,用于癌症早期的诊断与治疗方面提供了可能。