Id1蛋白是DNA结合/分化抑制因子(Inhibitor of DNA binding/differentiation，Id)家族(包括Id1，Id2，Id3，Id4)蛋白的一种，从属于HLH转录因子家族，其编码蛋白缺乏DNA结合必需的碱性氨基酸序列，与bHLH结合成异二聚体(Id-bHLH)后，抑制bHLH与DNA及其他组织特异性bHLH转录因子结合。bHLH类转录因子是目前已知的体内重要的一大类转录因子家族，参与细胞命运和细胞分化过程的基因调控。Id1通过这种负显性调控作用抑制了bHLH转录因子对下游分子的激活作用，调控细胞的命运及分化过程。　　 研究发现，Id1蛋白在正常细胞发育中随细胞分化逐渐降低，在分化终末时极少表达或不表达，但在多种来源的肿瘤组织中高表达，显示Id1具备癌基因的特性。1999年，美国学者LydenD在Nature杂志上发表文章，认为Id1和Id3是新生血管包括肿瘤新生血管生成的必要因素，此后Id1基因与肿瘤关系的研究成为新的热点，Id1蛋白在多种肿瘤组织中的高表达被相继报道。在某些恶性肿瘤中，Id1的表达程度与肿瘤组织的恶性度、侵袭性或新生血管形成及预后等呈正相关，表明Id1在某些恶性肿瘤的发生发展中起重要作用。由于Id1与某些肿瘤的生长侵袭特性密切相关，因而Id1蛋白检测对于评判某些肿瘤的进展和预后具有极高的研究价值，而针对Id1蛋白的靶向治疗设计也受到特别关注并已开始相关的实验研究。　　 国内近两年在肺癌、肝癌、胃癌、肾癌中相继报道了Id1的表达，在乳腺癌研究中报道较少。从开展乳腺癌根治术到今天的综合治疗，经历了100多年，虽然诊断水平和治疗效果不断提高，但是乳腺癌的发病率仍位于女性恶性肿瘤的首位，且病死率居高不下，严重的威胁着女性的健康。随着分子生物学技术的发展，乳腺癌的基因治疗研究取得了很大进展，有望成为乳腺癌治疗的新途径。故本研究以乳腺癌为研究对象，研究乳腺癌组织及乳腺癌细胞中Id1的表达及其意义，应用RNA干扰技术沉默乳腺癌细胞Id1基因表达，探讨抑制Id1基因表达的抗癌效果，旨在为以Id1为靶点从事基因治疗乳腺癌提供临床及实验依据。　　 第一部分 Id1在乳腺癌组织中的表达及其与临床生物学关系的研究　　 目的：探讨乳腺癌组织中Id1的表达及意义。　　 方法：采用免疫组化S-P法检测正常乳腺组织、浸润性导管癌组织中Id1的表达，并分析其与乳腺癌临床病理特征的关系。　　 结果：Id1在乳腺浸润性导管癌中的表达率为18.07±11.10％，较正常乳腺组织中(1.39±1.57％)显著性增高(P＜0.01)。Id1在Ⅰ、Ⅱ级浸润性导管癌中表达率为12.55±5.12％和16.46±8.88％，显著低于Ⅲ级(37.61±6.84％)(P＜0.01)。Id1在50岁以上组与小于50岁组表达率为21.17±12.71％和15.52±9.00％，肿瘤最大径2cm以上与小于2cm组为18.16±11.53％和17.33±10.50％，腋淋巴结转移组与无转移组为21.86±11.97％和16.57±10.51％，表达率比较差异均无显著性(P＞0.05)。Id1在乳腺浸润性导管癌中的表达与ER、PR表达呈负相关(r=-0.529，P＜0.01;r=-0.483，P＜0.01)，而与C-erbB-2表达程度无相关性（r=0.129，P＞0.05）。　　 结论：　　 1 Id1在正常乳腺组织中无表达或微弱表达，在乳腺癌组织中高表达，并与病理组织学分级相关，病理组织学分级越高、临床恶性程度高的乳腺癌Id1的表达越高，提示：Id1的表达与乳腺癌的发生发展有关，是乳腺癌的重要肿瘤标志物。　　 2 Id1的表达与患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无关。　　 3 Id1的表达与ER、PR表达呈负相关，提示其高表达在浸润性导管癌激素依赖型转变为非激素依赖型中起作用；Id1的表达与C-erbB-2表达无相关性。　　 第二部分 Id1在人乳腺癌细胞株中的表达及沉默Id1的表达对其生长、增殖及凋亡的影响　　 实验一 Id1在人乳腺癌细胞株中的表达　　 目的：检测Id1在三种乳腺癌细胞株中的表达，探讨其在不同侵袭转移能力乳腺癌细胞株中差异表达的意义。　　 方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测三种人乳腺癌MCF-7（雌激素受体阳性、低侵袭性）、MDA-MB-468（雌激素受体阴性、低侵袭性）MDA-MB-231（雌激素受体阴性、高侵袭转移性）细胞株中Id1mRNA和蛋白的表达，分析其对乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响。　　 结果：Id1mRNA在三种乳腺癌细胞株MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231中均呈阳性表达，Id1mRNA相对表达量分别为0.193±0.078、0.180±0.072、0.499±0.058;Id1蛋白相对表达量分别为0.186±0.073、0.504±0.092、1.293±0.111。Id1蛋白相对表达量在乳腺癌MDA-MB-231细胞株中最高，MDA-MB-468细胞株中次之，MCF-7中最低。Id1表达程度随细胞侵袭转移能力的增强而升高，在分化程度低、ER阴性的乳腺癌细胞株高于分化程度较好的ER阳性细胞株。　　 结论：　　 1 Id1 mRNA和蛋白在三种乳腺癌细胞株中均呈阳性表达，说明Id1与乳腺癌的发生有关，是乳腺癌的重要肿瘤标志物　　 2 Id1 mRNA和蛋白在不同侵袭能力的乳腺癌细胞株中差异明显，其表达程度随着侵袭能力的增强而升高。说明Id1是影响乳腺癌细胞的侵袭转移能力的重要因子。　　 3 Id1蛋白的表达在雌激素受体阴性细胞株中显著高于雌激素受体阳性细胞株，提示：Id1蛋白表达是影响乳腺癌雌激素受体表达的重要因素。　　 4人乳腺癌MDA-MB-231细胞株中的Id1 mRNA和蛋白水平表达最高，是以Id1为靶点从事基因沉默治疗乳腺癌的研究的理想细胞株。　　 实验二 Id1-RNAi重组质粒的细胞转染与鉴定　　 目的：应用Id1的siRNA表达载体，转染高表达Id1的人乳腺MDAMB-231细胞，鉴定筛选抑制效率高的Id1RNAi重组质粒，为后续实验做准备。　　 方法：应用针对Id1基因编码的Id1特异性siRNA载体质粒Id1-RNAi-1、Id1-RNAi-2、Id1-RNAi-3，体外瞬时转染人乳腺癌MDA-MB231细胞，RT-PCR和Westem blot方法检测3种重组质粒对转染后细胞中Id1mRNA和蛋白的表达，并比较其干扰效果。筛选作用干扰效果好的Id1-siRNA载体质粒，转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞，并筛选扩增阳性细胞，建立稳定转染细胞系。　　 结果：Id1-siRNA载体质粒瞬时转染MD-MB-231人乳腺癌细胞后，RT-PCR及Western blot结果显示转染3种重组质粒后MDA-MB-231细胞中Id1表达水平均显著降低：转染组细胞中Id1mRNA(相对表达量分别为0.288±0.094、0.547±0.090、0.511±0.087)比空染组及对照组（分别为0.979±0.112，1.007±0.122)显著降低(P＜0.01)。转染组细胞中Id1蛋白(相对表达量分别为0.111±0.108、0.386±0.116、0.628±0.121)比空染组及对照组(1.605±0.113、1.704±0.124)显著性低(P＜0.01)。其中以转染Id1-RNAi-1的细胞Id1表达水平降低最为明显（降低幅度约93％），转染另外两种重组质粒的细胞中Id1的表达水平下降相对较少，表明针对Id1的siRNA载体转染后Id1基因表达沉默，并以Id1-RNAi-1重组质粒沉默Id1效果最好。　　 结论：三种Id1-RNAi重组质粒，不同程度抑制乳腺癌细胞的Id1基因的mRNA和蛋白表达水平表达，以Id1-RNAi-1重组质粒的基因沉默效果最理想（Id1mRNA和蛋白表达降低幅度约93％），通过鉴定优选Id1-RNAi-1重组质粒，转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞，并筛选扩增阳性细胞，建立稳定转染细胞系，为后续实验作准备。　　 实验三沉默Id1的表达对人乳腺癌细胞生长、增殖及凋亡的影响　　 目的：观察Id1-RNAi/Id1的基因沉默后的乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为变化，检测凋亡相关的基因Bax、Bcl-2、Survivin mRNA的变化，进一步深入研究Id1基因沉默对乳腺癌细胞生物学行为的改变及引起凋亡的机制。　　 方法：采用MTT法检测Id1-RNAi/MDA-MB-231细胞增殖、生长情况；克隆形成实验观察Id1-RNAi/MDA-MB-231的克隆能力；流式细胞仪检测Id1RNAi对乳腺癌细胞周期和凋亡率的影响；RT-PCR检测Id1-RNAi/MDA-MB-231细胞Bax、Survivin、Bcl-2的mRNA水平变化。　　 结果：　　 1 MTT法检测Id1-RNAi/MDA-MB-231细胞与对照组比较，生长速度减慢、倍增时间延长。　　 2克隆形成实验观察到Id1-RNAi/MDA-MB-231细胞与对照组比较形成克隆数明显减少。　　 3流式细胞仪检测Id1RNAi细胞与对照细胞周期的构成比分别为，G0/G1期：69.8±5.4％和42.6±2.3％;S期：21.6±1.8％和28.4±1.2％；G2/M期：9.6±1.45％和29±2.6％。对应比较差异均有显著性(P＜0.05)。Id1RNAi细胞与对照细胞的凋亡百分率分别为（14.58±2.34）％和（3.68±0.18）％，凋亡率显著性升高（P＜0.05）。　　 4 RT-PCR检测Bax mRNA的表达在Id1-RNAi乳腺癌细胞和对照组中的相对表达量分别为0.64±0.08和0.24±0.05;Bcl-2mRNA相对表达量在Id1-RNAi乳腺癌细胞和对照组中分别为0.38±0.08和0.54±0.09;Survivin-mRNA相对表达量在Id1-RNAi乳腺癌细胞和对照组中分别为0.76±0.15和0.89±0.10，差异均有有显著性(P＜0.05)。　　 结论：Id1的基因表达被沉默后，乳腺癌细胞周期被抑制，细胞增殖环节被阻滞，起到了对乳腺肿瘤生长的抑制作用。沉默Id1后通过提升BaxmRNA表达，下调Bcl-2mRNA，并引发了Survivin mRNA表达的相应沉默效应，使细胞凋亡显著增加。RNA干扰技术使Id1基因沉默达到了治疗乳腺癌的显著效果。　　 第三部分 Id1基因沉默的乳腺癌细胞在体内生长及侵袭能力的研究　　 目的：观察Id1RNAi/MDA-MB-231细胞在裸鼠体内的成瘤性，及形成瘤生长情况；检测裸鼠体内的形成瘤凋亡、VEGF及MMP-9蛋白表达的表达；研究在裸鼠体内Id1基因沉默的抗癌效果。　　 方法：将Id1-RNAi转染组和对照组的MDA-MB-231细胞分别接种于裸鼠左背部皮下。观察两组的成瘤及生长情况，绘制肿瘤生长曲线；流式细胞仪检测移植瘤组织中细胞凋亡变化；检测并分析裸鼠移植瘤组织中VEGF、MMP-9蛋白的表达变化。　　 结果：　　 1 接种Id1-RNAi转染组较接种MDA-MB-231细胞组的肿瘤生长速度减慢，肿瘤体积小。　　 2 流式细胞仪检测Id1RNAi组与对照组细胞的凋亡率分别为19.58±2.34％和8.24±0.86％，接种Id1RNAi组细胞凋亡率显著性升高(P＜0.01)。　　 3 转染组成瘤组织中VEGF和MMP-9蛋白的表达率分别为0.208±0.137和1.350±0.141，较对照组（1.619±0.244和2.031±0.032）显著性降低(P＜0.01)。　　 结论：Id1基因沉默通过增加细胞凋亡并降低VEGF、MMP-9蛋白的表达，抑制了乳腺癌肿瘤的生长，及侵袭转移的能力。体内实验显示：Id1基因沉默具有显著的抗瘤效果。