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本研究旨在为组织工程治疗神经损伤、疾病探索新的治疗策略——自聚合纳米纤维材料(self-assembling peptide nanofiber scaffold,SAPNS)介导RNA干扰(RNA interference,RNAi)RhoA表达促进脊髓损伤的修复。
目前治疗脊髓损伤的方法很多,外周神经移植、细胞移植、生物材料填充损伤腔以及消除抑制因子等。这些研究在一定程度上都促进了脊髓损伤的修复。然而,外周神经移植需要考虑神经来源、细胞移植也有其来源及伦理道德方面的局限、消除抑制因子不彻底、以及治疗策略的单一性、难以针对脊髓损伤修复困难的诸多不利因素等,都成为脊髓损伤修复的瓶颈。
因此,寻求新型生物材料和探索新的方法避免以上问题,从而为临床运用提供更具可行性的策略,成为脊髓损伤修复的研究热点。近年来,各种新方法和新型生物材料不断涌现。
SAPNS是近年来由美国麻省理工学院Zhang S课题组发明的一新型纳米材料,目前已经证明它在多种组织修复中能发挥良好的效果,被认为是组织损伤修复中最具应用前景的组织工程修复材料之一。其在组织损伤修复的运用中相比其他生物材料具有以下优势:不会引起明显的免疫排斥反应和炎症反应、其纳米纤维直径非常接近细胞外基质,能为细胞存活与迁移提供三维环境,能将携带生物致病源和污染的风险降到最低,具有极好的组织相容性,无细胞毒性,降低产物可被组织吸收利用。
研究表明RhoA在脊髓损伤修复中具有重要的作用。RhoA是属于Rho家族的一种小分子GTPase,它是所有真核细胞细胞骨架肌动蛋白的调节因子。RhoA在神经系统发育阶段对神经元迁移和突起的生长发挥重要作用,但在成年神经元中基本不表达。当神经元受损后8h,RhoA表达又开始增高,损伤后3d可达到高峰,并可持续高表达2w以上。RhoA在神经元损伤后重新高表达是中枢神经再生困难的一个重要因为。
目前已知的抑制神经再生的大部分相关因子都是通过激活下游的RhoA信号通路来发挥作用的。脊髓损伤后RhoA表达的增高可导致轴突生长锥塌陷以及受损神经元凋亡,这些都是导致脊髓损伤后再生困难的主要因为。因此,设法降低RhoA的表达或抑制其信号通路有可能成为促进脊髓损伤修复的一个新的治疗策略。
RNA干扰是近十几年来迅速发展起来的一种新型分子生物学技术,它可利用 siRNA,-shRNA或miRNA感染靶细胞以降低特定基因的表达。目前,已有不少关于导入 siRNA进行体内RNA干扰的报道。其中对中枢神经组织进行RNA干扰的方法主要有2种:即静脉注射和局部微量注射。然而静脉注射用药量大难以避免全身副作用,局部微量注射可对神经组织造成不必要的二次损伤。所以有必要探索更加确实可行的用药方法。
本研究在脊髓损伤模型的基础上,在损伤处移植含有 RhoA特异性 siRNA(RhoA—siRNA)和 SAPNS的复合材料,针对脊髓修复难点的多种复杂因素,以期在修复脊髓损伤处的同时减低RhoA的表达,从而探索促进脊髓损伤后结构与功能修复的新方法。
本研究分三个部分。
第一部分:移植材料构建以及脊髓损伤模型建立和移植。
昆明小鼠,雌性,65只,12周龄,30-35g;动物分组和每组数:假手术组(sham)10只,生理盐水组(saline)15只,SAPNS组17只,siRNA+SAPNS组23只。
无菌下取0.50DRhoA特异性干扰 RNA(RhoA-siRNA)或荧光标记 siRNA(FAM-siRNA),用6μl DEPC水溶解。取2μlsiRNA溶液,2μlLipofect2000以及10μlSAPNS,于干净的培养皿中迅速混合,后置于0.1M PBS溶液中4℃下孵育30min,使材料充分聚合。昆明小鼠麻醉后在小鼠 T7-9位置打开椎板,暴露脊髓,剪开硬脊膜后在T8位置垂直切除长度为1mm的一段脊髓。在形成的损伤腔内填充上述构建的移植材料或等量的生理盐水。
第二部分:siRNA转染效率和RhoA表达的检测。
siRNA转染效率检测:移植入 FAM-siRNA+SAPNS的小鼠在手术后2d,1w,2w取材,取材部位脊懿为 T6-11,脑为皮质运动区。后做冰冻切片,在荧光显微镜下观察并拍照,记录siRNA进入脊髓和大脑皮质运动区神经元的情况。结果显示,siRNA被脊髓神经元轴突摄取,并且顺利进入大脑运动皮质区神经元胞体。
RhoA表达的检测:手术后1w各组任取5只小鼠,取材切片。行RhoA免疫组织化学染色,检测RhoA表达。在荧光显微镜下观察损伤区及其附近神经元内RhoA表达情况,并拍照记录。结果显示,在RhoA-siRNA+SAPNS组中,RhoA表达显著降低。
第三部分:脊髓修复效果评定,行为学检测和轴突再生定量分析。
对实验所得计量资料轴突密度数据使用SPSS13.0统计分析软件进行方差分析(One-Way ANOVA)后用 LSD法作两两之间比较；BMS评分值用非参数Kruskal-Wallis H检验法多组间比较,组间两两比较用 Mann-Whitney U检验。
后肢功能评定:手术后10w对所有剩下小鼠进行后肢运动功能BMS评定。软件结果显示,RhoA-siRNA+SAPNS组小鼠功能恢复好于损伤组,组间差异有统计学意义。
轴突再生定量分析:术后10w取材切片,行轴突特异性标志蛋白NF200免疫组织化学染色,拍照,每只动物记录5张切片,使用图像分析系统(Image-ProPlus；Media Cybernetics,Silver Spring,Maryland)在所得图片损伤区每150μm插入一条与脊髓长轴垂直的直线,每张图片插入10条直线,计算NF阳性纤维和直线的交点总数。结果显示,RhoA—siRNA+SAPNS组见大量NF阳性纤维再生,多于损伤组,组间差异有统计学意义。