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冷藏贮运是保障原料乳品质的重要环节,但是在低温条件下嗜冷菌仍然能够生长繁殖,随着贮藏时间延长逐渐成为主要微生物。由于一些嗜冷菌能够产生耐热的脂肪酶和蛋白酶,原料乳加工过程中的常规热处理方法不能使其完全灭活,残余的酶会分解乳制品中的脂肪和蛋白质,导致乳制品品质下降。本论文采集中国北方主要产乳区多个牧场的原料乳,分析嗜冷菌的多样性,对优势嗜冷菌所分泌的脂肪酶和蛋白酶的耐热性进行研究,确立产耐热酶的典型嗜冷菌,建立并优化环介导等温扩增(LAMP)检测体系,旨在快速检测对原料乳品质破坏能力强的嗜冷菌,为原料乳品质的监测提供保障。将采集自北京、黑河和哈尔滨三个地区的原料乳样品分为两个部分,分别在0~5°C和5~10°C保存。采用PCR-DGGE方法分析两种温度条件下保存0、1和3 d的原料乳样品中嗜冷菌的多样性,结果发现,不同地区的原料乳菌群结构显著不同,相同储存条件下,同一地区的原料乳样品的相似度高于同一储存时间的原料乳样品。但是来自不同地区的原料乳样品中具有相同的优势菌Pseudomonadales和Lactobacillales。原料乳菌群结构也受到温度影响。5~10°C储存的原料乳中嗜冷菌的增长较0~5°C储存的原料乳中增长显著。随着储存时间的延长,L.lactis所占比例降低,Pseudomonas所占比例提高。从采集的原料乳样品中共分离出具有脂肪水解能力的嗜冷菌21株,具有蛋白水解能力的嗜冷菌26株。经16S r DNA鉴定发现,来自不同地区的原料乳中产脂肪酶/蛋白酶菌株所属菌种不同,但均属于Pseudomonas,其中Pseudomonas fragi的占比最高。优势嗜冷菌及其水解酶的耐热性研究发现嗜冷菌自身不具有耐热性,而其水解酶具有极强耐热性。在分离到的嗜冷菌中,38号嗜冷菌具有最强的产脂肪酶和产蛋白酶能力,所产酶也具有较强的耐热能力,该菌株的16s r DNA鉴定结果为Pseudomonas fluorescens。以NCBI数据库中公布的P.fluorescens和38号嗜冷菌脂肪酶和蛋白酶基因比对获得的保守区为目的基因,建立快速检测嗜冷菌脂肪酶和蛋白酶基因的LAMP检测体系,并从Mg2+、d NTPs和Bst DNA聚合酶的添加量,内外引物浓度比,反应温度和反应时间方面进行优化。优化后的LAMP和实时LAMP(RT-LAMP)检测方法均对P.fluorescens有较强的特异性,对分离得到的其他菌株和原料乳中常见的污染微生物Staphylococcus aureus、Salmonella typhimurium、Escherichia coli、Cronobacte sakazakii、Listeria monocytogenes和Shigella flexneri均无检测信号。在检测纯培养38号嗜冷菌时,以脂肪酶基因为目标的普通LAMP和RT-LAMP的检测限在相同数量级,均为4×102 CFU/mL,作为对照的PCR方法检测限是其10倍;以蛋白酶基因为目标的LAMP和RTLAMP的检测限一致,为3×102 CFU/mL,PCR检测限也是其10倍;在检测接种至巴氏灭菌乳中的38号嗜冷菌时,以脂肪酶基因为检测目标的LAMP和RT-LAMP的检测限一致,为6.1×102 CFU/m L,PCR检测限是其100倍;以蛋白酶基因为检测目标的LAMP和RT-LAMP的检测限一致,为8.9×102 CFU/mL,PCR检测限是其100倍。在用时方面,RT-LAMP的检测用时约为80 min,较LAMP的检测用时缩短约20 min。在实际生产中,脂肪酶和蛋白酶基因的LAMP检测可以同时进行,快速反映原料乳中所含危害嗜冷菌的数量,为乳制品品质提供保障。