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马铃薯甲虫Leptinotarsadecemlineata是马铃薯上的一种毁灭性害虫,也是我国重大检疫对象。阐明马铃薯甲虫重要糖代谢基因的生理功能,有利于新治理措施的开发。本文克隆获得32条马铃薯甲虫糖代谢基因cDNA全长。采用RNAi技术分别干扰海藻糖代谢基因LdTPS和LdTRE,以及几丁质合成关键基因LdUAP和LdChS,分析了干扰这些基因对马铃薯甲虫幼虫发育和成虫生殖的影响,阐明了海藻糖和几丁质在马铃薯甲虫生长发育、变态和生殖中的重要作用。获得如下结果:1.马铃薯甲虫糖-脂代谢基因的克隆及其对激素信号的响应基于马铃薯甲虫基因组和转录组数据,应用RACE技术获得32个糖类和脂类代谢相关基因的cDNA全长序列,这些基因编码的酶涉及海藻糖代谢、几丁质合成、糖酵解、三羧酸循环、戊糖磷酸途径、糖异生途径、糖原代谢和脂肪代谢。分析了海藻糖合成酶 LdTPS、海藻糖酶 LdTRE(LdTRE1a、LdTRE1b 和 LdTRE2)、UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶LdUAP(LdUAP1和LdUAP2)、和几丁质合成酶LdChS(LdChSAa,LdChSAb和LdChSB)在马铃薯甲虫幼虫期的表达,发现这9个基因的表达模式与20E和JH的峰值相关。进一步的生物测定结果表明,20-羟基蜕皮酮(20E)依赖其信号通路激活这9个基因的表达。JH负调控LdUAP1的表达,而正向调控其余8个基因的表达。这些基因对20E和JH信号的表达响应预示它们在马铃薯甲虫生长发育和生殖过程中的重要生理功能。2.海藻糖的代谢应用 RNAi 技术,分别敲低海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,ZLdTPS)和海藻糖酶(trehalases,LdTRE1a,LdTRE1b或LdTRE2)基因,探究了海藻糖在马铃薯甲虫幼虫生长发育过程中的重要功能。发现敲低LdTPS后,幼虫体内海藻糖含量显著降低,幼虫和蛹的死亡率提高,部分幼虫变态过程中表型异常。同时,存活幼虫的取食量显著增加,体重上升。生化分析结果表明,敲低LdTPS后,幼虫体内积累了较多的糖原、脂肪和脯氨酸,末龄幼虫的几丁质含量显著下降。当沉默LdTPS的幼虫取食海藻糖后,以上干扰效应得到不同程度的恢复,但取食葡萄糖无回补作用。敲低UdTRE1a后,幼虫体内海藻糖含量显著增加,幼虫和蛹的死亡率显著上升;存活幼虫的取食量减少,体重下降。生化指标检测结果表明,沉默LdTRE1a的幼虫脂肪、多种生糖氨基酸和几丁质含量均显著下降。喂食海藻糖和葡萄糖均不能回补LdTRE1a沉默幼虫的异常表型。敲低LdTRE1b后,没有观察到幼虫明显的生理生化变化。沉默LdTRE2后,幼虫死亡率显著升高,海藻糖含量在多个组织中均显著增加,脑-咽侧体-心侧体中的糖原含量显著下调。喂食葡萄糖可基本回补干扰效应,喂食海藻糖没有回补效果。综上所述,海藻糖调控幼虫取食行为和影响中肠对单糖的吸收;同时是脑能量供应和几丁质合成的重要底物。可见,海藻糖是马铃薯甲虫幼虫生长发育过程中不可或缺的二糖。3.几丁质的合成几丁质是昆虫表皮和源于表皮的其它组织如气管、前肠和后肠,以及中肠围食膜的主要组分。UDP-N-乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylases,UAP)和几丁质合成酶(chitin synthase,ChS)参与几丁质合成。在马铃薯甲虫中,获得了两个LdUAP(LdUAP1和LdUAP2),和三个LdChS(LdChSAa,LdChSAb 和 LdChSB)的 cDNA全长,其中,LdChSAa 和 LdChSAb 是 LdChSA 的两条可变剪切体。应用RNAi技术,分别沉默LdUAP1和LdChSA(LdChSAa和LdChSAb的共同区),发现大部分试虫在幼虫-幼虫、幼虫-蛹蜕皮过程中,以及成虫羽化过程中死亡;少量存活幼虫无论表皮,还是整头虫中的几丁质含量均显著下降;气管螺旋丝变细甚至观察不到。相反,分别敲低LdUAP2和LdChSB后,幼虫的取食量减少;中肠围食膜中几丁质含量下降;围食膜完整性被破坏;幼虫的发育受到抑制,体重减轻。同时沉默LdUAP1和LdUAP2,产生了单独沉默LdUAP1和LdUAP2的叠加效应。另外,沉默LdChSAa的干扰效应与沉默LdChSA一致,而沉默LdChSAb,主要影响蛹-成虫的蜕皮。说明LdChSAa在幼虫发育过程中起主要作用,LdChSAb起辅助作用。综上所述,ZdUAP1和LdChSA主要催化表皮和源于表皮的其它组织如气管、前肠和后肠几丁质合成,而ZdUAP2和LdChSB特异性的参与中肠围食膜几丁质的合成。4.糖代谢与雌虫生殖海藻糖和几丁质在昆虫卵巢发育过程中具有重要功能。马铃薯甲虫四个海藻糖代谢基因(LdTPS、LdTRE1a、LTRE1b和LdTRE2)和两个LdUAP在1-10日龄雌虫中均表达,第一个表达高峰出现在卵形成期(羽化3-5天),第二个高峰出现在雌虫产卵期(羽化9-10天)。LdChSB在雌虫羽化第3-5天高表达;而LdChSA的转录水平在羽化第一天最高,以后逐渐降低。沉默任何一个海藻糖代谢基因均抑制雌虫生长,影响血淋巴中海藻糖含量,提高成虫死亡率,减少产卵量。解剖卵巢发现,沉默LdTPS、LdTRE1a和LdTRE2均显著抑制了卵母细胞的发育,卵巢管管壁变薄,滞后甚至阻止了卵黄沉积。分别沉默LdUAP2、LdChSA和LdChSB,雌虫体重显著减少,雌虫死亡率均显著上升,几乎不产卵。另外,沉默LdUAP1、LdUAP2、LdChSA和LdChSB的雌虫,卵巢管数量下降,卵巢变小,管壁变薄,卵巢管中几乎没有卵黄原蛋白沉积。进一步的分析表明,RNAi干扰个体血淋巴中异常的糖含量扰乱了类胰岛素信号途径,从而影响卵黄原蛋白基因的转录和蛋白的合成。因此,马铃薯甲虫成虫中海藻糖和几丁质的正常代谢对雌虫生长、卵母细胞发育和卵巢结构的维持均十分重要。