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人乳头瘤病毒(HPV)能引起各种类型的上皮性疾病,低危型HPV(如HPV6和HPV11)会引起尖锐湿疣(CA)和复发性呼吸道乳头状瘤(recurrent respiratory papillomatasis,RRP)。高危型HPV(如HPV16和HPV18)会导致肛门生殖器和口咽部鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCCs),据估计,美国每年大约有34 000个新的HPV相关癌症被诊断,超过4 000人死于宫颈癌,大约1 100人死于肛门癌;在我国,宫颈癌发病率逐年增高,患病人群也呈年轻化趋势,15~44岁的年轻女性恶性肿瘤的死亡率排行中,宫颈癌位居第三。迄今临床上根治HPV非常困难。而光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)为HPV感染相关疾病的治疗带来曙光。PDT可以治疗高危型HPV阳性且持续感染一年以上患者以及CIN I、II患者。PDT是一种特殊的抗癌疗法,定位在细胞或组织中的光敏剂(photosensitizer,PS)被特定波长的光或激光激活后产生活性氧(ROS)或者单线态氧等一系列毒性活性氧物质,使细胞或组织产生氧化损伤,从而得到治疗目的。光源、细胞或组织中分子态氧以及光敏剂构成光动力学反应。光敏剂多替泊芬(Deuteporfin)是我国自主研发的创新卟啉类光动力药物。目前对以Deuteporfin为光敏剂的光动力治疗(Deuteporfin-PDT)诱导靶细胞死亡的相关机制还不了解。本研究以HPV18~+人宫颈癌Hela细胞为靶细胞,从诱导Hela细胞凋亡和自噬进行初步的研究,为Deuteporfin-PDT今后的临床应用提供实验依据和理论支持。实验主要结果如下:1、Deuteporfin介导光动力作用对宫颈癌Hela细胞的杀伤效应将细胞分为光动力对照组(Control组、Deuteporfin组、LED组)和光动力实验组。使用不同浓度的Deuteporfin避光孵育细胞后,经过一系列光剂量照射细胞。用CCK-8法检测细胞毒性,结果显示单纯的光敏剂Deuteporfin或者单纯的LED光源作用于细胞,与对照组相比,细胞的存活率差异无统计学意义。同一光照剂量、不同光敏剂浓度下,细胞的生存率有显著差异,对Hela细胞的生长抑制率随Deuteporfin浓度增加而显著提高。我们选择Deuteporfin浓度0.4μmol/L,光照剂量9 J/cm~2用于后续实验。使用倒置荧光显微镜观察Deuteporfin-PDT处理细胞后不同时间节点hela细胞的形态变化。在PDT后6 h细胞存活与死亡并存,细胞固缩,反光性差。以上结果表明,Deuteporfin-PDT能明显抑制人宫颈癌Hela细胞的活性,且其抑制作用呈Deuteporfin浓度-光照剂量依赖性。2、Deuteporfin介导的光动力诱导Hela细胞凋亡为探索Deuteporfin-PDT是否诱导Hela发生凋亡。用Hoechst33342染色荧光显微镜观察PDT后细胞形态学变化,发现Deuteporfin-PDT处理后24 h,Hela细胞出现细胞核固缩,有凋亡小体形成。用AnnexinV/PI染色-流式细胞仪检测细胞凋亡发现Deuteporfin-PDT组的凋亡率与对照组相比有明显差异。以上结果表明,多替泊芬介导的光动力诱导Hela细胞发生凋亡。3、Deuteporfin介导的光动力诱导Hela细胞自噬用MDC染色法检测细胞的自噬泡,透射电镜观察细胞自噬体,Western blot检测自噬相关蛋白LC-3、Beclin-1以及P62的表达情况。荧光显微镜下观察到Deuteporfin-PDT引起细胞自噬囊泡积聚。透射电镜下可见细胞的超微结构,胞浆内可见大量囊泡状包裹蛋白质或者细胞器,与溶酶体融合形成典型的自噬溶酶体。WB结果显示光动力后自噬标志蛋白LC3和Beclin-1生成增加,而P62生成下降,提示自噬发生。4、Deuteporfin-PDT诱导Hela细胞发生内质网应激内质网染色后通过共聚焦显微镜观察Deuteporfin进入Hela细胞后的亚细胞器作用靶点,发现光敏剂Deuteporfin靶向作用于内质网和线粒体上。Western blot检测Deuteporfin-PDT处理后Hela细胞中内质网应激标记物GRP78和CHOP的表达情况,可观察到GRP78和CHOP的蛋白表达水平均呈时间依赖性上调。提示Deuteporfin-PDT诱导Hela细胞发生内质网应激。