脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，由于胶质瘤细胞浸润性的生长方式，导致胶质瘤组织与正常脑组织之间没有明显的分界，手术难以达到根治性切除，术后复发率高，术后化疗仍是目前较为公认的降低脑胶质瘤患者复发率的重要手段之一。体外实验研究表明，一些最新发现的抗肿瘤药对体外培养的胶质瘤细胞，均有较好的杀伤作用，但对于在体肿瘤组织则效果不佳，究其原因不在于抗肿瘤药物本身，而是由于没有足够浓度的抗肿瘤药物能够进入胶质瘤组织内。　　 由于血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)及血肿瘤屏障(blood-tumor barrier，BTB)的存在，阻止了大部分抗肿瘤药物通过BTB进入肿瘤组织。一些研究显示如果肿瘤组织的药物浓度提高两倍，其治疗效应则增加十倍。因此，寻找到合适的方法或药物，使其能够选择性的开放血肿瘤屏障，使抗肿瘤药靶向进入肿瘤组织，提高药物疗效，而又不影响正常血脑屏障的通透性，减少药物对正常脑组织的毒副作用，对脑胶质瘤的治疗有特殊重要的意义。　　 药物通过BBB一般有两种途径：细胞旁途径和跨细胞途径。构成BBB及BTB的基本结构是脑微血管内皮细胞(brain microvessl endothelial cells，BMECs)，它们之间的紧密连接(tight junctions，TJs)是保持BBB和BTB屏障作用完整性的关键因素。ZO-1、Claudin-5及Occludin等紧密连接相关蛋白在维持紧密连接的结构和功能中起重要作用。因此，改变BMECs的紧密连接相关蛋白表达的变化，将会引起BBB和BTB通透的变化，增加抗肿瘤药物经细胞旁途径透过BTB进入肿瘤组织的量，从而提高化疗的疗效。　　 低频超声是指频率范围在20 kHz～1 MHz波长的超声波，具有在组织中易穿透，声能吸收少，对组织损伤小的特点。最近研究表明：应用低频超声可以非侵袭性、可逆性、选择性开放血脑屏障，而不损伤辐照部位的脑组织，为中枢神经系统药物转运提供了一个新途径。但其具体机制不清。　　 肿瘤坏因子-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)具有广泛的生物学功能。中枢神经系统内的小胶质细胞、星形细胞、神经细胞和血管内皮细胞均可产生TNF-α。TNF-α可直接作用于脑血管内皮细胞，可逆性增脑血管内皮细胞的通透性。　　 任何应激都会引起组织细胞产生热休克因子-1(heat shock factor-1，HSF-1)，进而产生一种保护性蛋白质热休克蛋白-70(heat shock protein-70，HSP-70)；HSP-70和TNF-α基因存在同源启动子。低频超声作为一种应激刺激因素同样会引起组织细胞内HSF-1的激活，活化的HSF-1不仅可以启动HSP-70基因的表达，同时也可能启动TNF-α基因的表达。　　 我们推测低频超声辐照时，可能会通过细胞内HSF-1和HSP-70信号传导通路，使胶质瘤细胞TNF-α表达上调，然后由胶质瘤细胞分泌的TNF-α作用于胶质瘤组织中的微血管内皮细胞，引起微血管内皮细胞紧密连接相关蛋白结构和功能的改变，从而引起血肿瘤屏障通透性的改变。　　 本研究采用低频超声辐照实验性大鼠脑内C6胶质瘤模型和体外胶质瘤血肿瘤屏障模型，检测辐照前后血肿瘤屏障通透性的变化及TNF-α表达的变化；以及HSF-1和HSP-70表达变化与TNF-α表达的变化之间的关系；ZO-1、Claudin-5及Occludin等紧密连接相关蛋白表达的变化。研究TNF-α在低频超声开放血肿瘤屏障过程中的作用机制，证实TNF-α是低频超声开放血脑肿瘤屏障过程中的关键因素之一，为低频超声作为一种中枢神经系统药物转运的方式提供实验依据。　　 方法：低频超声辐照：应用EMS-9B型经颅多普勒超声仪，采用直径2cm的脉冲波多普勒(pulsed wave Doppler，PW)探头，发射频率1.0MHz，发射功率12mW。　　 (一)在体实验研究　　 1、制备实验性大鼠脑内C6胶质瘤模型。　　 2、应用伊文思蓝(Evans blue)渗透法测定血肿瘤屏障通透性。　　 3、透射电镜观察血肿瘤屏障超微结构的变化。　　 4、ELISA法测定C6胶质瘤侧脑组织中TNF-α含量的变化。　　 5、免疫组织化学(S-P法)和免疫荧光法检测C6胶质瘤组织中TNF-α表达分布和水平的变化。　　 6、RT-PCR法检测C6胶质瘤组织内TNF-αmRNA表达的变化。　　 7、免疫蛋白印迹(western-blotting)法检测C6胶质瘤组织中HSF-1和HSP-70蛋白表达水平的变化。　　 8、RT-PCR检测C6胶质瘤组织内HSF-1和HSP-70 mRNA表达的变化。　　 9、免疫荧光法检测C6胶质瘤组织中紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达分布和水平的变化。　　 (二)体外实验研究　　 1、大鼠脑微血管内皮细胞(RBMECs)的培养。　　 2、C6细胞与RBEMCs条件共培养。　　 3、MTT法测定C6细胞增殖状态。　　 4、ELISA法测定C6细胞培养液中TNF-α含量的变化。　　 5、免疫组织化学(S-P法)检测C6细胞中TNF-α表达的变化。　　 6、RT-PCR法检测C6细胞中TNF-αmRNA表达的变化。　　 7、双重免疫荧光染色法检测C6细胞内HSF-1、HSP-70及TNF-α表达的变化。　　 8、免疫组织化学(S-P法)和免疫荧光法检测RBEMCs紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5表达的变化。　　 结果：　　 (一)在体实验部分　　 1、低频超声辐照后，BTB通透性先增加后下降的趋势，在1.5h～3h达到高峰，到12h时BTB的通透性又恢复到辐照前的水平。　　 2、低频超声辐照后，0.5h至9h胶质瘤组织中的脑微血管内皮细胞紧密连接(TJs)均有不同程度的开放，辐照后12h时关闭。　　 3、低频超声辐照后，C6胶质瘤侧大脑半球中TNF-α的含量在1.5h～3h时达到高峰，辐照后12h时恢复到正常水平。　　 4、低频超声辐照后，TNF-α主要表达在胶质瘤组织中的肿瘤细胞及血管内皮细胞中，并在1.5h～3h时达到高峰，至辐照后12h时恢复正常水平。　　 5、低频超声辐照后，胶质瘤组织中TNF-αmRNA的表达在1.5h～3h时达到高峰，至辐照后12h恢复正常水平。　　 6、低频超声辐照后，胶质瘤组织中HSF-1和HSP-70蛋白的表达在1.5h时达到高峰，辐照后12h时恢复到正常水平。　　 7、低频超声辐照后，胶质瘤组织中HSF-1和HSP-70 mRNA的表达在1.5h时达到高峰，至辐照后12h恢复正常水平。　　 8、紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5在胶质瘤组织中的表达部位主要位于脑微血管内皮细胞中；低频超声辐照后，ZO-1、Occludin和Claudin-5表达水平开始下降，至辐照后1.5h时，表达水平最低，12h恢复正常水平。　　 (二)体外实验研究　　 1、低频超声辐照后，C6胶质瘤细胞培养液内TNF-α的含量在1.5h～3h时达到高峰，辐照后12h时恢复到正常水平。　　 2、低频超声辐照后，C6胶质瘤细胞中TNF-αmRNA的表达水平于辐照后1.5h～3h时显著升高达到高峰，然后逐渐下降，至辐照后12h恢复正常水平。　　 3、低频超声辐照后，TNF-α主要表达在C6胶质瘤细胞膜和细胞浆内，在辐照后1.5h～3h表达水平达到高峰，辐照后12h恢复到正常水平。　　 4、低频超声辐照后，C6胶质瘤细胞内HSF-1和HSP-70、TNF-α表达的变化趋势一致，均在2h时达到高峰，12h时恢复到正常水平。　　 5、低频超声辐照后，RBMECs紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5表达降低，至辐照后2h达到最低。　　 结论：　　 1、低频超声辐照(频率1.0MHz，功率12mW，辐照时间20s)能够长时程的、可逆性的选择性开放血肿瘤屏障。　　 2、低频超声辐照能够刺激胶质瘤细胞增加分泌TNF-α，上调胶质瘤细胞TNF-α的表达。　　 3、低频超声辐照通过细胞内HSF-1和HSP-70信号传导通路，使胶质瘤细胞中TNF-α表达的上调。　　 4、低频超声辐照能够降低BMECs紧密连接相关蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-5的表达，引起TJs的开放。　　 5、低频超声辐照可以通过细胞旁途径开放血肿瘤屏障；TNF-α表达上调是其中的关键环节之一。