论文部分内容阅读
【研究背景和目的】肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSC)理论认为只有存在于肿瘤中的少量干细胞性质的细胞群体对肿瘤发生和发展起着决定作用,这一理论的提出为肿瘤研究提供了新的方向,对肿瘤的早期诊断、等级评估及预后都有重要意义,为临床上彻底治愈肿瘤带来希望。卵巢癌严重危害女性健康,研究卵巢癌尤其是上皮性卵巢癌的有效治疗方法具有重大意义,肿瘤干细胞理论的提出为卵巢癌的早期诊断和彻底治疗提供了新的思路。CSC分离的关键问题是寻找合适的表面标记,本实验旨在探讨人上皮性卵巢癌细胞中CD133和CD44的表达状况及其对自我更新、分化增殖能力的影响。【材料和方法】1.本研究所选用的卵巢癌组织标本均取自山东大学齐鲁医院妇产科2007年5月至2007年11月间手术切除并经病理证实为上皮性卵巢癌的标本,同时术中采集腹水分离培养原代细胞。上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、3AO、A2780、OVCR3均来自山东大学齐鲁医院肿瘤中心中心实验室。2.流式细胞术检测CD133和CD44在SKOV3、3AO、A2780、OVCR3和原代培养细胞中的表达率。3.免疫组织化学染色检测卵巢癌组织标本中CD133和CD44分布情况。4.免疫磁珠法(magnetic beads cell sorting,MACS)分选出SKOV3细胞中CD133~+细胞。5.CD133~+细胞自我更新、分化增殖能力检测:用含20%新生牛血清(neonatalbovine serum,NBS)的培养液培养CD133~+细胞,于分离后即刻、培养第3天、培养第5天三个时间点用流式细胞术检测其中CD133~+细胞所占的比例。6.统计学方法:数据分析采用SPSS13.0软件,多重均数之间比较采用单因素方差分析,两组均数比较用独立样本t检验,P＜0.05为差异有显著性。【结果】1.原代培养细胞生长状况显微镜下观察细胞形态扁平,较为规整,呈多角形,第一代细胞常混杂有非肿瘤细胞,一般传至第二代以后非肿瘤细胞少见,细胞之间相互衔接紧密排列。细胞每7天传代一次。2.流式细胞术检测CD133和CD44的表达率SKOV3、A2780、3AO、OVCR3中CD133的表达率分别为0.72%±0.10%、0.94%±0.22%、0.81%±0.50%、0.77%±0.28%,四种细胞系间CD133的表达率无显著性差异(P=0.85)。SKOV3中CD44的表达率为96.92%±1.74%,而A2780、3AO、OVCR3中均为检测到CD44的表达。原代培养细胞中CD133的表达率,第Ⅲ代培养细胞共检测了6例,其表达率为1.27%±0.54%;第Ⅰ代细胞检测6例,其表达率为0.47%±0.13%。第Ⅲ代细胞CD133表达率高于第Ⅰ代细胞(P=0.002);与细胞系比较,第Ⅲ代细胞CD133表达率高于SKOV3(P=0.046),与A2780、3AO、OVCR3差别无统计学意义。第Ⅲ代培养细胞中CD44的表达率为79.48%±13.21%,第Ⅰ代细胞为93.42%±0.65%。第Ⅲ代细胞CD44表达率低于第Ⅰ代细胞(P=0.049);第Ⅲ代细胞CD44表达率亦低于SKOV3细胞中CD44表达率(P=0.002)。由于原代培养细胞检测例数少,未发现CD133、CD44表达率与患者的病理类型、分化程度等临床指标之间的关系。3.免疫组织化学染色结果DAB阳性染色为棕黄色,所检测的12例卵巢癌组织标本中CD133和CD44均呈阳性,且分布广泛。4.CD133~+细胞自我更新、分化增殖能力检测观察CD133~+细胞生长状况,其生长速度快于CD133~-细胞(具体数据未检测),分离后即刻、培养第3天、培养第5天流式细胞术所测CD133~+细胞所占的比例分别为76.74%、11.91%、2.26%,明显呈下降趋势。【结论】1.本研究发现CD133在0.16%～2.05%的上皮性卵巢癌细胞中表达,CD133~+细胞有自我更新能力,能够产生大量CD133~-细胞,具有肿瘤干细胞特征,表明CD133可以作为上皮性卵巢癌肿瘤干细胞的表面标记进一步研究,为上皮性卵巢癌中肿瘤干细胞的分离、培养和鉴定提供了基础。2.CD44在SKOV3和原代培养的上皮性卵巢癌细胞中表达(66.37%～98.87%),在A2780、3AO、OVCR3细胞中不表达,而肿瘤干细胞是占肿瘤细胞极少数的一群细胞,所以我们认为CD44不能作为上皮性卵巢癌肿瘤干细胞的表面标记。