研究背景外阴皮肤和粘膜的病变主要包括外阴上皮内非瘤样变、外阴鳞状上皮内瘤样变和外阴癌。外阴上皮内非瘤样变是女性外阴皮肤和粘膜组织色素改变和变性的一组慢性疾病,包括外阴硬化性苔癣、外阴鳞状上皮细胞增生和其他皮肤病。外阴硬化性苔癣是妇科常见的慢性炎症性皮肤病,是一种较难治疗的、易复发的疾病。最常见的症状是顽固性外阴瘙痒,有些患者表现为排尿困难、性交痛和外阴烧灼感,另一些患者可以无症状。病变特点为外阴萎缩、皮肤颜色变白、发亮、皱缩、变脆、弹性差,常伴有皲裂和破溃难愈。长期患病会引起一系列后遗症,包括外阴形成瘢痕、阴道口狭窄以及普遍存在的性心理障碍,大约4%-6%的患者可能发展为外阴鳞状细胞癌,因此有人将其视为外阴癌前病变。外阴鳞状上皮内瘤样变是一种发生于女性外阴的较少见的疾病,临床表现为白色、灰褐色或红色斑丘疹或斑块,可单发或多发。组织学表现以基底膜以上表皮细胞成熟紊乱、胞核异常为特点。根据最新制订的分类标准,按照有无人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)感染将其分为寻常型和分化型二种,前者与高危型HPV病毒感染有关;而后者与HPV感染无关,并可能是外阴硬化性苔癣向外阴鳞状细胞癌进展的一个很短暂的上皮病变过程。这二种外阴鳞状上皮内瘤样变均被认为是癌前病变。而外阴鳞状细胞癌是由不同分化程度的鳞状上皮细胞构成的浸润性癌,是最常见的外阴癌,占外阴恶性肿瘤的80%-90%。其发病率虽然仅占女性生殖系统恶性肿瘤的5%左右,但在75岁以上妇女中其发病率约占25%,与最常见的女性恶性肿瘤—宫颈癌的发病率相近。近年来,外阴鳞状细胞癌发病率升高,患者有渐趋年轻化倾向。目前认为其发病主要有二条途径,一与外阴长期慢性炎症刺激有关,与HPV感染无关,其癌前病变为外阴硬化性苔癣和/或分化型外阴鳞状上皮内瘤样变,主要见于老年妇女;二与高危型HPV感染有关,即寻常型外阴鳞状上皮内瘤样变为其癌前病变,其主要发病人群为年轻妇女。外阴皮肤和粘膜的病变广泛发生于各年龄阶段的妇女,而长期以来对此领域的研究相对较少,至今各种病变的发病机制均不明,导致临床治疗上存在很大困难。缺氧是某些生理、病理现象发生的根本原因,也是实体肿瘤微环境的基本特征之一,在多种恶性肿瘤及癌前病变中均可见到相关研究。缺氧导致一系列基因和蛋白的表达,可以刺激肿瘤细胞血管生成和糖酵解,上调一些生长因子以及肿瘤侵袭相关蛋白的表达,使肿瘤细胞发生恶性转化、浸润,甚至转移。缺氧诱导因子-1及其下游靶基因的表达是多种恶性肿瘤的预后因子,也预示着放化疗抵抗,并具有靶向治疗作用。然而,缺氧微环境与外阴鳞状细胞癌的发生、进展的相关性研究在国内外尚未见报道。研究目的研究缺氧相关因子和细胞增殖标记物在正常对照外阴皮肤、外阴硬化性苔癣、外阴鳞状上皮内瘤样变和外阴鳞状细胞癌中的表达及其与外阴鳞状细胞癌的临床病理资料间的相关性,探讨缺氧在外阴病变的发生和发展过程中的作用,探讨缺氧与细胞增殖的相关性,并为进一步研究可靠的外阴鳞状细胞癌的预后因子提供科学依据。研究方法本研究回顾性研究山东大学齐鲁医院病理科和皮肤科2002年1月-2007年12月存档的石蜡组织标本,包括外阴硬化性苔癣41例、寻常型外阴鳞状上皮内瘤样变10例、外阴鳞状细胞癌25例,另取正常外阴皮肤12例,组织切片进行免疫组织化学染色检测缺氧相关因子,包括缺氧诱导因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α,HIF-1α)、葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter-1,GLUT-1)、碳酸酐酶-9(carbonic anhydrase IX,CA IX)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)及细胞增殖标记物Ki-67蛋白的表达。对外阴鳞状细胞癌患者的临床病理资料进行分析,随访。结果1.GLUT-1在正常外阴皮肤中表达水平很低,明显低于外阴硬化性苔癣、外阴鳞状上皮内瘤样变和外阴鳞状细胞癌(P＜0.05),在外阴鳞状细胞癌中表达最高(P＜0.05)。2.CA IX在正常外阴皮肤和硬化性苔癣中均无表达,在外阴鳞状上皮内瘤样变和外阴鳞状细胞癌中表达增多(P＜0.05),后二者比较差异无统计学意义(P＞0.05)。3.VEGF在外阴鳞状细胞癌中表达最高,其次为外阴鳞状上皮内瘤样变(P＜0.05),明显高于硬化性苔癣和正常外阴皮肤,后二者的表达无显著性差异(P＞0.05)。4.Ki-67在外阴硬化性苔癣、外阴上皮内瘤样变及外阴鳞状细胞癌中均较正常外阴皮肤表达显著增多(P＜0.05),而后二者比较无显著性差异(P＞0.05)。5.HIF-1α在各组中均未见明确的细胞核表达。6.在各组外阴病变中,缺氧相关因子与细胞增殖标记物Ki-67之间均未见相关性;GLUT-1与VEGF的表达间均存在显著的正相关关系,而CA IX与VEGF的表达无明显相关性。7.外阴鳞状细胞癌的1年、3年及5年生存率分别为75%,70%,64%,未见明显的预后因子。结论1.缺氧参与外阴病变的发生及恶性进展,GLUT-1异常高表达可能是病变进展的早期事件,CA IX和VEGF的表达是晚期事件。2.在回顾性研究中,GLUT-1可能是比HIF-1α更敏感的内源性缺氧标记物;HIF-1α表达不稳定,可能出现假阴性表达;CA IX在外阴组织中表达不敏感。3.缺氧与细胞增殖之间未见相关性。4.外阴鳞状细胞癌是一种预后较好的恶性肿瘤,缺氧相关因子不是判断其预后的理想因子。意义缺氧与外阴病变的相关性研究在国内外尚未见报道,本研究初步探讨了缺氧相关因子在外阴鳞状细胞癌的发生、恶性进展中的作用,为此领域的进一步研究提供有益的研究基础。研究背景外阴硬化性苔癣是妇科常见的慢性炎症性皮肤病,是一种较难治疗的、易复发的疾病。本病可见于任何年龄,国外报道在青春期前和绝经后妇女中发病率较高,其发病率呈双峰态势;但国内报道以40岁左右妇女多见,其次为幼女。本病最常见的症状是顽固性外阴瘙痒,有些患者表现为排尿困难、性交痛和外阴烧灼感,另一些患者可以无症状。病变特点为外阴萎缩、皮肤颜色变白、发亮、皱缩、变脆、弹性差,常伴有皲裂和局部皮肤破损。长期患病会引起一系列后遗症,包括外阴瘢痕形成、阴道口狭窄以及普遍存在的性心理障碍,大约4%-6%的患者可能发展为外阴鳞状细胞癌。病理诊断是目前唯一的确诊方法。至今外阴硬化性苔癣的病因及发病机制尚不清楚,目前的研究认为可能与自身免疫因素、遗传因素、内分泌因素、新陈代谢、感染及局部因素等有关。外阴硬化性苔癣的早期诊断和治疗对于妇科医生、皮肤科医生、病理科医生和儿科医生都是一种挑战,需要多学科间的协作以深入研究。近年来国内外学者对外阴硬化性苔癣的病因及发病机制进行了大量深入的研究,对其临床治疗也进行了广泛的探索,但目前仍缺乏统一的治疗方法和疗效评价标准,国际上认为局部应用糖皮质激素是治疗硬化性苔癣的首选,但其引起的局部萎缩、皮肤刺激等副作用使治疗陷入困境。而国内学者应用中西医结合治疗方法进行探索,取得了可喜的研究成果。我们在积山东大学齐鲁医院对本病三十余年的临床与实验研究的基础上,自拟克白霜治疗本病,研究其临床疗效和作用机理。研究目的本研究旨在系统观察克白霜治疗外阴硬化性苔癣的临床疗效,探讨其作用机理,以期探索出一条治疗外阴硬化性苔癣的有效途径,为克白霜的推广应用提供有力的临床与实验依据。研究方法参考《中医妇科学》、《妇产科学》、《实用妇产科学》和《中药新药临床研究指导原则》制定外阴硬化性苔癣的临床诊断、中医辨证分型标准及疗效评定标准。将确诊为外阴硬化性苔癣的102例患者,随机分为两组,克白霜治疗组51例,丙酸氯倍他索软膏西药对照组51例;另取30名正常妇女的空腹血清和12名正常妇女的外阴皮肤做正常对照组。重点观察克白霜治疗组和西药对照组治疗前后的外阴瘙痒疼痛情况、外阴皮肤粘膜的病变范围和色素改变情况,检测治疗前后血清T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+和免疫球蛋白IgG、IgA、IgM及超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的变化,观察治疗前后局部组织CD3、CD4、CD8、CD68和缺氧相关因子GLUT-1和VEGF的表达情况,并分别以光镜和透射电镜观察治疗前后的组织细胞形态学变化。同时了解克白霜在各中医辨证分型中的最佳适用证型,随访观察其长期用药的毒副作用和预防癌变的作用。动物实验观察克白霜对大鼠棉球肉芽肿的抑制作用和对4-氨基吡啶引起的过敏致痒的止痒作用。结果1.克白霜治疗组总有效率60.78%,丙酸氯倍他索软膏西药对照组总有效率33.33%,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05),治疗组疗效优于西药对照组。2.克白霜能有效改善外阴硬化性苔癣患者的临床症状和体征,各中医辨证分型问疗效未见明显差异。3.治疗前患者的血清CD3+、CD4+下降,CD8+升高,CD4+/CD8+下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。克白霜治疗组治疗后CD3+、CD4+升高,CD8+下降,CD4+/CD8+升高,与正常对照组比较无显著性差异P＞0.05)。西药对照组于治疗前后各项指标比较无显著性差异(P＞0.05)。两组治疗后各项指标比较差异有统计学意义(P＜0.05)。4.治疗前患者血清IgG水平下降,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。克白霜治疗组治疗后IgG升高,与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。西药对照组于治疗前后IgG水平比较无显著性差异(P＞0.05)。两组治疗后IgG水平比较差异有统计学意义(P＜0.05)。5.治疗前患者血清SOD水平下降、MDA水平升高,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。克白霜治疗组治疗后血清SOD水平明显升高,MDA水平降低,与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。西药对照组于治疗前后SOD和MDA水平比较无显著性差异(P＞0.05)。两组治疗后SOD和MDA水平比较差异有统计学意义(P＜0.05)。6.免疫组化研究发现在治疗前患者的病变皮肤中,明显增多的CD3+、CD4+淋巴细胞以几乎相同的比例存在于真皮炎细胞浸润带中,少量CD3+、CD4+淋巴细胞存在于表皮真皮连结附近,偶见于表皮下层。CD8+淋巴细胞和单核巨噬细胞标记物CD68+细胞很少存在于病变皮肤中。两组治疗前后CD3、CD4的表达比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);两组治疗后CD3、CD4的表达比较,差异均无统计学意义(P＞0.05)。7.治疗前患者病变皮肤的GLUT-1表达显著增多,而血管内皮细胞和周细胞的VEGF表达显著减少,与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。克白霜治疗组治疗后GLUT-1表达减少,VEGF表达增多,与正常对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。西药对照组于治疗前后各项指标比较均无显著性差异(P＞0.05)。8.光镜观察发现,两组治疗后表皮角化过度减轻,棘细胞层数增多,上皮脚出现,基底层空泡变性消失或明显改善,黑素细胞增多,真皮乳头恢复,真皮水肿和胶原均质化带消失或明显改善,炎细胞浸润明显减少。9.透射电镜观察细胞超微结构发现,外阴硬化性苔癣治疗前上皮基底膜厚薄不一,局部增厚、菲薄或断裂,半桥粒结构稀疏,可见上皮中的部分物质从断裂处突入真皮;基底细胞线粒体明显肿胀,可见嵴缺失和空泡化,有些线粒体内有膜性小体形成,黑色素颗粒减少。真皮毛细血管减少,局部管壁菲薄、迂回曲折,可见大量朝向管腔的胞质突起,多数毛细血管的管腔狭窄呈裂隙状,内皮细胞胞质中内质网肿胀,线粒体空化、嵴缺失,连接复合体无明显异常;毛细血管周细胞和真皮中大部分细胞均有明显的线粒体肿胀。克白霜治疗后,上皮基底膜厚度均匀,半桥粒丰富;基底细胞线粒体结构正常,可见趋于正常的嵴的排列,内质网无肿胀,黑素颗粒丰富。真皮毛细血管的内皮细胞胞质中线粒体结构正常,可见明显趋于正常的嵴的排列,内质网无肿胀,高尔基复合体结构正常,毛细血管的管腔未见狭窄。10.随访期间治疗组未见任何明显毒副作用,对照组部分患者可见皮肤萎缩加重、皮肤刺激。两组均未见一例恶变。11.动物实验表明,克白霜大、中剂量组与对照组比较,对大鼠棉球肉芽肿均有显著抑制作用,而西药丙酸氯倍他索软膏组无明显抑制作用,克白霜大、中剂量组与西药组比较差异有统计学意义(P＜0.05);克白霜大、中剂量组对4-氨基吡啶引起的过敏致痒有较好的止痒作用,且量效关系明显,克白霜大剂量组与西药组比较荠异无统计学意义(P＞0.05)。结论1.外阴硬化性苔癣是一种T淋巴细胞介导的炎症性的、氧化与抗氧化平衡失调的疾病,可能缺氧缺血机制参与发病。2.克白霜是治疗外阴硬化性苔癣的理想药物,临床疗效满意。3.克白霜的作用机制为调节机体免疫功能及氧化与抗氧化平衡,改善局部缺氧缺血微环境,改善局部组织细胞形态。4.随访表明克白霜长期外用无任何明显毒副作用,可预防癌变。5.克白霜药效学研究表明,克白霜有较好的抗炎、止痒作用。意义本研究为外阴硬化性苔癣提供了新的病因病机学说—缺氧缺血参与其发病,为治疗外阴硬化性苔癣提供了一种新制剂—克白霜,为制定统一的临床诊断标准、中医辨证分型标准及疗效评定标准提出了一种新方法,具有广泛的临床应用价值。