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肿瘤严重威胁着人类生命健康。肿瘤疫苗能诱导抗原特异性的抗肿瘤免疫反应，在肿瘤防治上已经显示出一定的效果，被认为是最具前景的肿瘤治疗方法。但因缺乏肿瘤特异性抗原及高效的抗原递呈等，疫苗的效果远不能令人满意。黑色素瘤抗原(Melanoma Antigen，MAGE)是首先被发现的人类肿瘤特异性抗原，MAGE-3是MAGE家族重要的成员之一，广泛表达于多种组织的肿瘤，而在除睾丸和胎盘外的正常组织中均不表达，是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子。基于MAGE-3的肿瘤疫苗能诱导MAGE-3特异性CTL的产生，在肿瘤免疫治疗方面倍受重视，但仍需提高疫苗的免疫原性以提高疫苗效能。热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)具有分子伴侣作用，参与肿瘤抗原的加工递呈，在诱导肿瘤免疫反应中发挥重要作用。最近研究表明，将结核杆菌HSP70与目的抗原融合是提高疫苗效能的有效方法。 本研究拟克隆人MAGE-3基因，制备HSP70-MAGE-3融合蛋白疫苗和DNA疫苗，检测其抗肿瘤免疫反应，并利用小鼠肿瘤模型观察其对表达MAGE-3肿瘤的治疗作用。 1：人MAGE-3基因的克隆、原核表达及其在小鼠黑色素瘤细胞第四军医大学博士学位论文中的裹达 目的:克隆人MAGE一3基因，并对其3’端360bP片段编码的12Oaa蛋白进行诱导表达与分离纯化;建立稳定表达MAGE一3的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:通过Rl’- PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE一3全长cDNA;采用软件分析MAGE一3蛋白的抗原性;经PCR扩增MAGE一3基因3’端360bp片段，构建重组原核表达质粒pET一MAGE一3，对含有该质粒的大肠杆菌BLZI(DE3)进行诱导表达和分离纯化;构建真核表达质粒PIREsZ一EGFP一MAGE一3，脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞，G418筛选阳性克隆，荧光显微镜和Rl’- PCR分别检测阳性克隆中增强型绿色荧光蛋白(enhaneed green fluoreseent Protein，EoFP)的表达和MAGE一3 mRNA的表达。结果:从人黑色素瘤LIB:细胞系总RNA中克隆了MAGE一3基因，测序结果与GeneBaxlk公布的MAGE一3序列一致;MAGE一3在C端的1 20aa左右具有较高的抗原性;扩增了MAGE一3基因3’端360bP片段，成功构建了pET一MAGE3质粒，通过原核表达与分离纯化，得到纯度为85%的17kD蛋白;成功构建了真核表达载体PIREsZ一EGFP一MAGE一3，转染B16细胞后筛选得到阳性克隆，可见融和蛋白表达产生明亮的绿色荧光，Rl’- PCR检测到MAGE一3 mRNA的表达。结论:克隆了人MAGE一3基因并对其3’端360bP片段编码的120aa蛋白进行原核表达和分离纯化:构建了真核表达质粒PIREsZ一EGFP-MAGE一3，建立了稳定表达MAGE一3的小鼠B 16一MAGE一3细胞系，为研究MAGE一3在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了基础。2:HsP70与MAGE一胜合.白咬苗的构建及抑.效应的研究 目的:制备HSP70与MAGE一3融合蛋白疫苗，检测其对小鼠细胞和体液免疫的作用，观察对肿瘤的治疗作用。方法:构建pE下HsP7o、pE下HsP7o一MAoE一3原核表达质粒，诱导表达;蛋第四军医大学博士学位论文白疫苗免疫C57BU6小鼠，ELISPOT检测脾淋巴细胞中释放IFN一y细胞频数，LDH释放实验检测CTL对B16一MAGE一3细胞的特异性杀伤作用，EUSA检测血清中抗MAGE一3的抗体水平;观察疫苗对B16一MAGE一3肿瘤的治疗作用。结果:获得了HSP7O蛋白和HsP70一MAGE一3融合蛋白;蛋白疫苗免疫C57BU6小鼠后，HsP70一MAGE一3组脾淋巴细胞中分泌IFN一丫的T细胞数量、对B16一MAGE-3的特异性杀伤作用和血清抗MAGE一3抗体水平均显著大于MAGE一3组、HSP70组、MAGE一3+HSP70组(P<0.OI):HSP7O一MAGE一3疫苗能够显著抑制B16一MAGE一3肿瘤生长，显著延长荷瘤小鼠生存期，但融合蛋白疫苗不能抑制B16肿瘤生长，对小鼠生存期亦无影响。结论:制备了HSP7O一MAGE一3融合蛋白疫苗;该疫苗能够诱导强烈的MAGE一3特异性的细胞免疫和体液免疫反应，HSP70融合MAGE一3能够显著增强疫苗的效能，对表达MAGE一3抗原的肿瘤具有显著的治疗作用。3:HSp70与M[A GE一胜合DNA痊苗构趁及抑公效应的研究 目的:制备HSP70与MAGE一3融合DNA疫苗，检测其抑瘤效应。方法:构建MAGE一3、HSP70及两者融合基因的真核表达质粒;DNA疫苗免疫C57BU6小鼠，ELISPOT、LDH释放实验、ELISA等检测其对小鼠细胞和体液免疫的作用，观察疫苗对B16一MAGE一3肿瘤的治疗作用。结果:成功构建了真核表达质粒peDNA一MAGE一3、peDNA一HSP7O、peDNA一HSP70一MAGE一3，DNA疫苗免疫小鼠后，与MAGE一3组、HSP70组、MAGE一3+HSP70组比较，HSP70一MAGE一3组脾淋巴细胞中分泌IFN斗的T细胞数量显著增多，CTL对B16一MAGE一3的特异性杀伤作用显著增强 (尸<0.01);但各组血清抗MAGE一3抗体水平没有明显差异 (P>.05);HSP70一MAGE一3疫苗组B16一MAGE一3肿瘤体积显著小于其它组(尸<0.01)，荷瘤小鼠生存期显著大于其它组(尸<0.01);第四军医大学博士学位论文同其它疫苗一样，该疫苗对B16肿瘤生长和荷瘤小鼠生存期无影响。结论:HSP70一MAGE一3融合DNA疫苗能够增强表达MAGE一3肿瘤的特异性的细胞免疫，对表达MAGE一3的肿瘤有良好的治疗作用，HSP70与肿瘤抗原基因?