山新杨富含羟脯氨酸糖蛋白编码基因(PdPapHRGP1)抗逆功能研究

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山新杨不仅是生态保护和防护树种,也是当今绿化的优良树种。富含羟脯氨酸糖蛋白(HRGPs)是高等植物细胞壁中一种独特结构蛋白,它广泛存在于高等植物中,在抵抗病原物侵染方面起重要作用。本研究以山新杨为材料,基于前期构建的转录组数据,筛选并克隆了山新杨PdPapHRGP1基因(Potri.003G129400.v3.1)。通过生物信息学分析、采用q RT-PCR技术检测PdPapHRGP1基因在不同组织和多种胁迫条件下的组织表达模式,以及利用转基因技术,获得山新杨PdPapHRGP1基因过表达株系(O1-1、O1-3和O1-6),验证了PdPapHRGP1的抗逆功能。该研究结果为揭示PdPapHRGP1基因的功能和通过基因工程技术获得山新杨高抗种质资源奠定了基础。主要研究结果如下:1.获得目的基因PdPapHRGP1。生物信息学分析结果表明:PdPapHRGP1基因的开放阅读框为1363 bp,编码453个氨基酸。PdPapHRGP1蛋白分子量为49.079k Da,理论等电点为5.13,是一种稳定的亲水性非跨膜蛋白。该蛋白存在一个保守区结构域“PHA02682”。亚细胞定位预测在细胞核中,约占73.9%。PdPapHRGP1蛋白二级结构预测为α-螺旋占19.43%,延伸链占16.78%,β-转角折叠占1.77%和无规卷曲占62.03%。系统发育树分析表明,该PdPapHRGP1与小垫柳(Salix brachista)KAB5564519.1的亲缘关系最近。2.qRT-PCR技术分析PdPapHRGP1在不同组织和不同胁迫下的表达模式。结果表明:该基因在茎尖、叶、茎和根中均有表达,其在成熟叶中的表达量最高,是幼茎(S1)的19.8倍,与对照组相比,在非生物、生物胁迫和激素诱导均有表达变化。其中,盐、碱胁迫下该基因在各个组织部位均显著上调表达;受干旱处理该基因在叶和根显著上调表达,为对照的2.71和1.37倍;受病原菌侵染该基因在根显著上调且受尖孢镰刀菌影响最大,是对照的1.61倍;茉莉酸和脱落酸能诱导PdPapHRGP1基因在根显著上调表达,分别为对照的上调5.67和9.76倍,受水杨酸诱导仅在叶中显著上调表达,为对照的8.97倍;棘孢木霉Ta536能诱导该基因在茎尖显著上调表达,为对照的10倍。3.构建p ROK2-HRGP1过表达重组载体,通过农杆菌介导叶盘法法转化野生山新杨,获3个不同表达水平的阳性过表达株系。对60 d龄过表达山新杨组培移栽苗的生长特性、光合特性、特异基因协同表达、以及对外界非生物胁迫抗性及病原菌胁迫耐受性进行了分析。结果表明:与野生型相比,PdPapHRGP1基因过表达山新杨表现出显著的生长优势、较强的光合能力、以及对非生物和生物胁迫较高的抗逆性。并发现PdPapHRGP1与WAK、ASPG、ERF34、WRKY22和BBE等基因存在共表达关系。
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