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目的:
1.检测线粒体DNA(mtDNA)复合体Ⅲ(CytB)基因变异在甲状腺肿瘤患者中的发生情况。
2.探讨mtDNA突变位点和多态性位点与甲状腺肿瘤的关系。
3.分析研究甲状腺肿瘤患者mtDNACytB基因变异与临床资料之间的关系。
方法:
1.标本的收集:根据病理诊断结果,于温州医学院第一附属随机收集了80例甲状腺肿瘤患者经HE染色的5μm厚手术冰冻切片以及相匹配的患者外周血。其中包括甲状腺癌60例(甲状腺乳头状癌59例和甲状腺滤泡状癌1例)和甲状腺良性肿瘤20例(腺瘤型结节性甲状腺肿1例和甲状腺腺瘤19例),同时收集其每位患者的临床资料。
2.全基因组DNA的提取:在病理医生指导下使用光学显微镜对组织切片进行肿瘤组织和肿瘤旁正常组织的区分,并分别刮取肿瘤组织和肿瘤旁正常组织。进而使用酚-氯仿法提取肿瘤组织和肿瘤旁组织的全基因组DNA。使用试剂盒法提取血液标本的全基因组DNA
3.PCR扩增:使用线粒体通用引物的第21对和22对引物扩增mtDNACytB基因的全序列。
4.测序比对:使用第二代I11uminaHiSeqTM2000测序仪对经PCR扩增产物进行测序。参照线粒体标本序列(rCRS),以患者自身的外周静脉血序列为对照,应用CodoncodeAligner软件对mtDNACytB的变异情况进行分析。进一步分析氨基酸改变,且运用生物软件进行保守性分析,借助蛋白质数据库对二级结构进行预测,探讨CytB基因变异的致瘤分子机制。
5.统计分析:结合患者的临床资料,通过统计学方法分析来探讨线粒体DNAcomplexV突变与患者的临床病理资料之间的关系。
结果:
1.通过对80例甲状腺肿瘤mtDNACytB基因的检测,发现在60例甲状腺恶性肿瘤中有5个病人发生基因突变占总恶性肿瘤总数的8.4%。在20例良性肿瘤病人你中仅发现一例突变为Tb114号病人,其占良性肿瘤总数的5%。这六个突变位点中有2个异质性突变,4个同质性突变。
2.对甲状腺肿瘤病人单核苷酸多态性的分析发现,60例恶性肿瘤病人中有39个多态性位点,20例良性肿瘤病人中共发现了15个多态性位点。这80例甲状腺肿瘤病人中有4个多态性位点在标本中出现的频率接近50%或大于50%,且有一个多态性位点(A15362G)分布在全部肿瘤病人标本中。对病人多态性分析时我们还发现一些患者往往同时存在几个不同的多态性位点,其中在18例恶性肿瘤患者中同时存在3个多态性位点,良性肿瘤中同时存在3个多态性位点的病人有6例。
3.对突变位点氨基酸的分析,发现六个突变位点中有5个发生了错义突变,1个发生了无义突变,且有3个氨基酸发生了极性改变。对错义突变或无义突变进行保守性分析并对二级结构进行预测发现错义突变并没有明显引起CytB二级结构改变。
4.对甲状腺癌病人CytB基因突变和包括患者性别、年龄、家族史、肿块大小、甲状腺功能指标等临床资料进行统计学分析,统计学分析结果显示P值均>0.05统计结果无意义。
结论:
1.在本研究样本例数(包括60例恶性和20例良性甲状腺肿瘤)和地域(温州地区)范围内,线粒体DNAcomplexⅢ突变在恶性肿瘤组和良性肿瘤组两组间的突变率无统计学差异(P值>0.05),但检测到的错义突变和无义突变的二级结构预测能引起蛋白质结构的改变,推测其在甲状腺肿瘤的发生发展中起一定作用。
2.G15043A、A15326G在研究对象中检测到变异率均大于95%。是欧洲人群中少见的多态性位点,这两个位点可成为中国人群mtDNA序列的参考位点和对来源于欧洲人群的剑桥参考序列的一个修正。
3.本研究范围内线粒体DNAcomplexⅢ突变与甲状腺肿瘤患者的性别、年龄、家族史、肿瘤大小以及甲状腺功能指标(促甲状腺素、游离甲状腺素和游离三碘甲状腺原氨酸)无相关性。