论文部分内容阅读
目的:γδT细胞是宿主固有免疫应答的主要效应细胞,它桥联固有免疫和适应性免疫,在抗感染、抗肿瘤、免疫调节和维持免疫耐受等方面发挥重要的生物学功能。本研究用沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm)经呼吸道感染诱导小鼠沙眼衣原体肺炎。首先探讨Cm呼吸道感染诱导的γδT细胞在感染肺组织的增殖、活化及功能。其次我们探讨小鼠肺组织γδT细胞亚群的组成及其Cm感染后发生的变化;进一步探讨主要的γδT细胞亚群Vγ1+T和Vγ4+T细胞在沙眼衣原体呼吸道感染后的增殖、活化及分泌细胞因子IL-17和IFNγ的能力,从而明确γδT细胞及其亚群在小鼠衣原体肺炎中的作用,为胞内菌感染免疫学机制提供理论依据。方法:WT小鼠(C57BL/6鼠)经鼻腔吸入1×103 IFU(衣原体包涵体形成单位)的沙眼衣原体小鼠肺炎菌株(Cm),建立小鼠沙眼衣原体肺炎模型。1.分离感染后不同时间点小鼠肺组织单个核细胞,用荧光标记的抗鼠CD3、TCRγδ及CD69抗体染色,流式细胞术检测小鼠肺组织CD3+TCRγδ+T细胞的百分率、CD69的表达水平,利用细胞内细胞因子染色技术检测γδT细胞IFNγ和IL-17的分泌,明确Cm感染诱导γδT细胞的增殖活化和功能。2.用Cm呼吸道感染WT小鼠和TCRδ-/-小鼠,每天监测小鼠的一般状况和体重变化,用酶联免疫法检测小鼠肺组织衣原体包涵体形成单位(IFU),肺组织病理切片行H&E染色观察两种小鼠肺组织炎症,明确γδT细胞在衣原体肺炎中的作用。3.取健康小鼠及Cm感染后不同时间点的肺组织,利用RT-PCR技术检测肺组织γδT细胞各亚群mRNA的表达,探讨γδT细胞亚群在小鼠肺组织的分布及Cm感染后的变化。4.取Cm感染后不同时间点小鼠肺组织单个核细胞,用荧光标记的抗鼠CD3、TCRγδ、TCRVγ1和TCRVγ4抗体染色,流式细胞术检测小鼠肺组织Vγ1+T、Vγ4+T细胞占γδT细胞的百分比及其细胞数,用抗鼠CD69抗体检测Vγ1+T、Vγ4+T细胞CD69的表达,探讨两种γδT细胞亚群的增殖和活化;利用细胞内细胞因子染色技术分别测定Vγ1+T、Vγ4+T细胞分泌IFNγ和IL-17的水平,探讨小鼠肺组织γδT细胞亚群在Cm感染中分泌细胞因子的能力。结果:一定剂量的Cm经呼吸道感染诱导小鼠沙眼衣原体肺炎。与未感染组比较,Cm感染诱导小鼠肺γδT细胞百分率及细胞数逐渐升高,于感染后第7天达到高峰(p<0.01);Cm感染可诱导肺γδT细胞活化,CD69表达于感染后第3天及第7天水平显著增高(p<0.01,p<0.05)。Cm感染诱导γδT细胞在感染早期(前3天)分泌大量IFNγ和IL-17参与宿主抗衣原体免疫应答。TCRδ-/-小鼠在感染Cm后,表现出比WT小鼠更严重的疾病体征,说明γδT细胞在沙眼衣原体感染中发挥一定的免疫保护作用。根据TCRγ链的不同,小鼠γδT细胞分为Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T、Vγ7+T 6个γδT细胞亚群,其组织分布尚无确切结论。我们首先对γδT细胞亚群在健康小鼠肺组织的分布进行了研究,RT-PCR结果显示,小鼠肺组织存在Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T 5种γδT细胞亚群,其含量Vγ2>Vγ4>Vγ1>Vγ6>Vγ5。在Cm感染后,肺Vγ4+T和Vγ1+T细胞含量显著增高,Vγ4+T细胞在第3天达高峰(p<0.001),Vγ1+T细胞在第7天达高峰(p<0.001)。Vγ6+T细胞含量也在感染后有所增加,在第7天升高显著(p<0.01),Vγ2+T细胞和Vγ5+T细胞在感染后无显著变化。用流式细胞术进一步检测肺组织Vγ1+T、Vγ4+T细胞占γδT细胞的百分率及细胞总数,结果显示Cm感染可诱导肺Vγ1+T细胞百分率及细胞数逐渐升高,于感染后第7天达到高峰(p<0.01),之后下降,Vγ4+T细胞百分比和细胞数在感染后迅速升高,第3天达高峰(p<0.001),随后下降;活化分子CD69的表达结果显示Vγ1+T细胞在感染后第7天活化百分比最高(p<0.01),Vγ4+T细胞在第3天最高(p<0.01);结合Vγ1-Vγ4-γδT细胞占肺总γδT细胞的比例,提示Cm感染在早期主要诱导Vγ4+T细胞增殖,感染中后期,Vγ1+T细胞成为增殖的主要γδT细胞亚群。对于以上两群细胞产生细胞因子的研究显示,Vγ1+T细胞在Cm感染后可分泌IFNγ但不分泌IL-17,Cm感染诱导的IFNγ产生在感染第7天达高峰(p<0.01);而Vγ4+T细胞于感染后可同时分泌大量IFNγ和IL-17,Cm感染后其细胞因子分泌水平迅速升高,于感染后第3天达高峰(p<0.001),之后下降,至感染中期降至基础水平,结果表明Vγ4+T是γδT细胞在衣原体感染早期分泌IFNγ和IL-17参与免疫应答的主要细胞亚群。结论:沙眼衣原体呼吸道感染可诱导小鼠肺组织γδT细胞的增殖、活化并在感染早期分泌大量细胞因子IFNγ和IL-17,在Cm呼吸道感染中发挥免疫保护作用。小鼠正常肺组织中存在5种γδT细胞亚群:Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T,其中Vγ1+T和Vγ4+T细胞是Cm感染后肺组织γδT细胞增殖的主要亚群。Vγ1+T细胞可分泌IFNγ但不分泌IL-17,Cm感染可诱导其分泌IFNγ水平升高;Vγ4+T细胞可同时分泌IFNγ和IL-17,Vγ4+T细胞是γδT细胞在Cm感染早期分泌IFNγ和IL-17参与免疫应答的主要细胞亚群。