第一章KIR及其配体HLA-C基因多态性与肺结核的关联研究[研究背景]结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)感染引起的具有传染性的疾病之一。2012年WHO发布的全球结核病报告指出,2011年全球约有870万新发结核病例,有140万人死于结核病。我国是结核病高负担国家之一,根据第五次全国结核流行病调查报告显示,如果不采取有效的控制措施,未来的10年我国可能有近5000万的人感染结核病菌。结核病属于慢性细胞内感染,主要通过表达于免疫细胞表面的受体与结核杆菌的识别介导天然和适应性免疫应答,进而激活抗原提呈等反应,控制结核菌的感染。因此,结核病的发生、发展及转归与机体的免疫系统的变化密切相关,参与结核免疫应答的任一环节发生变化,可能就会影响到个体的免疫应答水平,从而影响个体对疾病的易感性以至于影响疾病的发生发展。杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptor, KIR)是NK细胞和某些效应T细胞表面表达的可以特异性识别人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA) I类分子的受体,具有重要的免疫调节作用。目前,KIR基因家族由8个与抑制功能有关的基因(2DLI,2DL2,2DL3,2DL4,2DL5,3DL1,3DL2和3DL3)、6个与活化功能有关的基因(2DS1,2DS2,2DS3,2DS4,2DS5和3DS1)、2个假基因(3DP1x和3DP1v)及1D组成。KIR蛋白结构包括胞外区、跨膜区和胞内区,胞外区有免疫球蛋白样结构域,可以与其配体HLA-I类分子结合,它的跨膜区和胞内区决定了KIR受体传导的是激活信号还是抑制信号。KIR基因座位编码在常染色体19q13.4,具有高度的多样性,表现为结构和功能的多样性：①不同的个体携带不同的KIR基因数目及种类；②等位基因多样性；③基因型的多样性；④单倍型(haplotype)的高度多样性。迄今为止,人类白细胞抗原系统是最具多态性的系统,是染色体上的一群紧密连锁的基因群,位于6p21.3,可分为HLA-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类基因,其中,HLA-A、B、C为经典的HLA-I类基因。HLA-C属于经典的HLA-I类基因,根据HLA-C分子第77、80位氨基酸的不同可分为HLA-C1组(HLA-Cw01、Cw03、Cw07、Cw08及其他相关分子)和HLA-C2组(HLA-Cw02、Cw04、Cw05、Cw06和其他相关分子)。KIR可特异性地识别表达于靶细胞表面的HLA-I类分子,形成受体-配体复合物,通过传导抑制或活化性信号来调节靶细胞的活性。KIR参与多种疾病的发生发展,包括类风湿关节炎、血管炎、Ⅰ型糖尿病和丙型肝炎等。随着KIR基因及配体在免疫应答中的作用研究,KIR基因及配体与感染性疾病遗传易感性的关系引起了人们极大的关注。据文献报道,墨西哥人结核病KIR2DL3基因频率明显高于正常人,但是,KIR基因与肺结核的关联性在中国尚未见报道,我们推测,KIR基因可能与中国汉族人肺结核的遗传易感性有关,因此我们做了以下的研究。第一节KIR基因多态性分析[目的]通过研究KIR基因在肺结核患者及正常对照中的多态性,探讨KIR基因多态性与肺结核的遗传易感性是否存在关联,以期明确其介导的免疫遗传因素在肺结核发病中的作用。[方法]1.研究对象：研究分析的400例样本包括200例肺结核患者和200例健康对照人群。病例组来自2010年至2012年间在山东省立医院和山东省胸科医院收治的临床确诊的肺结核汉族住院患者,健康对照来自山东省立医院和山东省胸科医院查体无血缘关系的随机健康汉族个体。所有的患者和健康对照人群在采集标本前均被告知并签署知情同意书,研究方案取得医院伦理委员会批准。2.基因组DNA的提取：所有患者和健康对照外周静脉采血3ml,EDT抗凝,按照操作说明采用外周血DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取,-20℃保存备用。3.KIR基因分型：用序列特异性引物聚合酶链式反应方法对所有样本进行KIR基因分型,KIR基因位点检测6个抑制性基因(2DLI,2DL2,2DL3,2DL5,3DL1,3DL3)、6个活化性基因(2DS1,2DS2,2DS3,2DS4,2DS5,3DS1)、2个假基因(3DP1x和3DP1v)及1D。引物根据KIR的基因序列及文献设计。应用GeneAmp9700扩增仪进行产物的扩增。4.电泳和成像：扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳,用凝胶图像分析仪进行电泳图象的分析,以便对每个样本进行KIR基因分型分析。5.统计学分析：用SPSS16.0软件对各组KIR基因表现频率、基因频率、基因型频率和单倍型频率进行统计学分析,筛选结核病的易感候选基因,明确与结核病不同临床感染状态相关的KIR易感基因。[结果]1.肺结核患者组KIR2DS1、KIR2DS3、KIR3DS1基因的阳性率较对照组增高,且具有显著性统计学差异(P<0.001,P<0.001和P<0.001)。2.选择性分析79例菌阴患者和30例菌阳患者中所有被测的KIR基因,发现与菌阳患者组相比,KIR2DS4和KIR2DS5在菌阴患者组的频率较高且具有显著性差异(P<0.001和P=0.001)；与对照组比较,菌阴组KIR2DS1、2DL3和2DS4阳性率增高(P=0.013,P=0.000和P<0.001)；与对照组相比,菌阳组KIR2DS3的阳性率增高(P=0.011)。3.患者携带两个及以上活化KIR的频率较对照组明显升高(P<0.001)。4.按照常用的分型标准,基因型A/B在患者中的频率比对照组增高(P<0.001),而A/A的频率降低(P<0.001),B/B在二者中的频率无明显差异(P=0.226);按照Hsu的命名及判定标准,对照组中最常见的基因型是AJ；菌阴组FZ14出现的频率最高；菌阳组FZ1出现的频率最高。5.单倍型A在对照组中的频率增高,而单倍型B在患者组中的频率增高,但是二者差异没有统计学意义。[结论]1. KIR2DS1、KIR2DS3、KIR3DS1可能为结核病的易感基因,肺结核患者相对于健康对照有不同的基因型、单倍型表现。2.机体免疫状态是决定结核杆菌感染预后和转归的主要因素。3.不适当的活化性/抑制性KIR基因比例可能是导致机体免疫平衡紊乱的遗传学基础。第二节HLA-C基因多态性分析[目的]通过研究人类白细胞抗原HLA-Cw在肺结核患者及正常对照人群中的多态性,探讨HLA-Cw多态性与肺结核的遗传易感性是否存在关联,为肺结核的病因分析和临床治疗提供理论依据。[方法]1.研究对象：所有病例的诊断及确诊同第一节。2.所有患者和健康对照外周静脉采血3ml,EDTA抗凝,按照操作说明采用外周血DNA提取试剂盒进行基因组DNA的提取,-20℃保存备用。3.KIR基因分型：参照文献设计引物,采用SSP-PCR反应进行基因扩增。HLA-Cw基因检测8个位点,HLA-Cw*01.HLA-Cw*02.HLA-Cw*03.HLA-Cw*04. HLA-Cw*05.HLA-Cw*06.HLA-Cw*07.HLA-Cw*08.应用GeneAmp9700扩增仪进行产物的扩增。4.电泳和成像：扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,用凝胶图像分析仪进行电泳图象的分析。5.统计学分析：用SPSS16.0软件进行统计学分析,表型频率通过直接计数阳性等位基因确定。[结果]1.HLA-Cw*08基因频率肺结核组显著高于对照组(P<0.001)；其他基因在两组的频率没有显著性差异。2.菌阳组HLA-Cw*04的频率高于菌阴组(P=0.025),而HLA-Cw*08的频率显著低于菌阴组(P=0.004)。[结论]HLA-Cw基因多态性与肺结核有一定的关联性,HLA-Cw*08可能是肺结核的易感基因,HLA-Cw*04和HLA-Cw*08等位基因可能与结核分枝杆菌的感染状态有关。第三节KIR基因和HLA-C与肺结核的关联性分析[目的]通过研究KIR基因及其HLA-Cw配体基因在肺结核患者及正常对照人群中的多态性,探讨KIR受体及其HLA-Cw配体介导的免疫遗传因素在肺结核发病中的作用。[方法]1.研究资料同前。2.统计学方法：KIR与HLA-C的关联研究按照阳性基因数/研究组总人数计算,患者组与对照组组间显著性差异分析用SPSS16.0软件包四格表卡方检验或Fisher确切检验。[结果]1. KIR2DL2/3及配体HLA-C1基因组合在患者组出现的频率高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05)。2. HLA-C2配体缺失时2DS1在患者中的频率显著升高。3.’no KIR2DS3and no Cw*08’基因组合在患者组的频率低于对照组,而基因组合’KIR2DS3and Cw*08’在患者组的频率高于对照组。4.基因组合’Cw*04and no KIR2DS1’在患者组出现的频率低于对照组。[结论]KIR基因与其配体HLA-Cw的相互作用可能参与了结核病的免疫反应过程。第二章肺结核患者KIR基因的表达研究[研究背景]目前,国内外很多研究者已筛选出了与人结核病相关的多个候选易感基因,并且在不同国家、地区、种族间进行了不同的探索研究,还包括了在分子水平上了解宿主遗传学因素对其发病病程的影响。KIR基因的表达和调控主要发生于转录水平,可能与转录区的甲基化有关联性。研究KIR的基因型,对研究疾病发生发展的机制可能是不够的,还需要在更深的层面上去研究作为遗传易感因子的KIR基因在疾病中发挥的作用。Pander.R等研究者在Nature杂志上发表声明,将KIR分子按白细胞分化抗原(CD)分为CD158a、CD158bl、CD158b2、CD158d。CD158信号系统在免疫反应中发挥怎样的功能目前还不是太清楚。国内缺乏对其结构和功能等与肺结核相关的研究报道,随着人类对结核病相关免疫研究的不断深入,免疫应答相关基因在mRNA及蛋白水平的表达越来越受到重视。因此,本章研究以山东汉族人群为对象,应用逆转录PCR法及实时荧光定量PCR法分析肺结核患者、健康对照人群外周血淋巴细胞的KIR基因mRNA的表达情况,初步对CD158分子在肺结核患者外周血表达的特点进行分析,以期研究结核患者、健康对照者KIR基因在外周血的表达情况,从而为预防治疗的进一步提高,提供理论和分子学的依据。第一节肺结核患者KIR受体mRNA在外周血的表达研究[目的]本节研究以山东汉族人群为对象,应用反转录PCR法及实时荧光定量PCR法分析肺结核患者、健康对照人群外周血淋巴细胞KIR在mRNA水平的表达情况。[方法]1.研究对象：研究分析的60例样本包括30例肺结核患者和30例健康对照人群。病例组来自2012年至2013年间在山东省立医院和山东省胸科医院收治的临床确诊的肺结核住院汉族患者,健康对照来自山东省立医院和山东省胸科医院查体无血缘关系的随机健康汉族个体。所有病例的诊断及确诊同第一章第一节。2.抽提总RNA及鉴定：所有患者和健康对照外周静脉采血5ml, EDTA抗凝,采用Ficoll密度离心法进行分离外周血淋巴细胞,按照RNAiso试剂盒进行RNA的抽提。测定抽提的RNA在波长260nm和280nm的紫外吸收值及RNA的浓度。3. RT-PCR反转录反应：每个PCR反应体系为20ul,以框架基因β-actin mRNA扩增产物为内参照,在内参均有扩增的条件下判定KIR基因KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、3DL1表达的情况。将扩增产物进行电泳以评价是否合成了符合要求的产物。4.实时荧光定量PCR：按照说明书使用SYBR Premix Ex TagTM试剂盒进行反转录、去除基因组DNA、Real-time PCR反应。每个PCR反应体系为20ul,扩增之后将扩增产物进行电泳以评价是否合成了符合要求的产物。5.统计学分析：用SPSS16.0软件进行统计学分析,若资料符合正态分布,结果以均值±标准差(x±S)来表示；若不符合正态分布,则以中位数±标准差(median±S)来表示。[结果]1.对肺结核患者和健康对照人群KIR的基因分型进行分析发现,有些个体KIR基因表现型频率与其表达率不相符,这可能是由于不同基因的mRNA水平有一定差异造成的。2.通过RT-PCR,患者KIR2DL3表达率较正常对照组升高(56.67%vs.30%,P=0.037),且差异有统计学意义。3.通过实时荧光定量PCR,肺结核患者KIR2DL3在mRNA水平的表达显著升高(1.17±0.38vs.0.94±0.25,P<0.01),且差异有统计学意义。[结论]肺结核患者抑制性KIR2DL3的表达可能受外周血淋巴细胞的调节影响；KIR基因型与表型的不相符可能会使其所表达KIR基因水平有很大的差异。第二节肺结核患者外周血CD158a和CD158b表达的研究[目的]本节研究以山东汉族人群为对象,应用流式细胞技术分析肺结核患者、健康对照人群外周血CD158的表达情况。[方法]1.研究对象：同第二章第一节。2.流式检测CD158a和CD158b的表达情况：10μl抗人CD3抗体,10μl抗人CD16/56抗体,10μl抗人CD158a抗体,10μl抗人CD158b抗体对PBMCs染色,同时标记同型对照。3.统计学分析：所得数据以均数±标准误表示,应用统计分析软件SPSS16.0对数据进行分析。差异对比分析前要先行正态分布检验和方差齐性检验,采用单因素方差分析和t检验,P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1.肺结核患者组CD3-CD16/56+的NK细胞上CD158a的表达率与正常对照人群相似,差别无统计学意义。2.CD158b的数量明显低于对照组,差别有显著性统计学意义(7.97±2.63%vs.9.58±2.92%, P=0.022)。[结论]CD158b所介导的抑制信号有可能会影响肺结核疾病的进展。第三章肺结核合并乙肝患者KIR基因的研究[研究背景]根据目前的流行病学调查,我国的肺结核发病率呈现出了上升趋势,同时也是一个乙肝大国,全国大约有一亿两千万人表现乙肝表面抗原阳性。目前尚未有确切的全国合并乙型肝炎病毒(HBV)感染的结核病患者的人数统计,但我国有大量的文献和研究结果表明,肺结核合并HBV病毒感染可以严重影响患者的生活质量,从而给家庭和社会带来极大的负担。通过研究KIR的基因多态性和肺结核合并HBV感染之间是否存在关联,以寻找肺结核合并HBV感染的易感性候选基因,从而探讨免疫遗传因素在其发病中的作用。其次,本研究应用流式细胞术分析CD3, GD16/CD56,CD158f在肺结核合并乙肝患者外周血单个核细胞中的表达情况,探讨肺结核合并乙肝感染者KIR的表达特征。最后,临床上,将CD56+CD3-的细胞认定为NK细胞。NK细胞的毒性杀伤实验能较好的展示NK细胞对靶细胞杀伤作用的影响,探讨新鲜分离的NK细胞对靶细胞的杀伤活性,以及其杀伤活性是否和KIR有关。第一节肺结核合并乙肝患者KIR基因多态性研究[目的]通过研究KIR的基因多态性和肺结核合并HBV感染之间是否存在关联,以寻找肺结核合并HBV感染的易感性候选基因,从而探讨免疫遗传因素在其发病中的作用。[方法]1.研究对象：选择2011年至2013年间在山东省立医院和山东省胸科医院收治的40例肺结核合并乙肝病毒感染患者和100例正常对照人群。2.易感性KIR基因筛选：应用PCR-SSP技术进行KIR基因分型分析。3.统计学分析：同第一章第一节。[结果]KIR基因2DL5、2DS1、3DS1在肺结核合并乙肝患者中的频率增高,且差异有显著性意义。KIR2DL5:70%vs.50%, P=0.031;2DS1:65%vs.26%, P<0.001;2DS3:67.5%vs.48%,P=0.037.[结论]KIR2DL5、2DS1和3DS1在患者中的频率高于健康对照组,提示这些KIR基因可能与MTB与HBV混合感染的易感性有关,并有可能会影响病情的发展与转归。第二节肺结核合并乙肝患者外周血NK细胞CD158f的表达[目的]本研究应用流式细胞术分析CD3,CD16/CD56,CD158f在肺结核合并乙肝患者外周血单个核细胞中的表达情况,探讨肺结核合并乙肝感染者KIR的表达特征；探讨结核合并乙肝患者新鲜分离的NK细胞对靶细胞的杀伤活性,以及其杀伤活性是否和KIR有关。[方法]1.研究对象：根据前一节的研究结果,筛选出了不同KIR基因型及表型的患者和健康对照,对标本进行了登记,为的是获得不同KIR表型的患者和健康对照的外周血PBMC/NK细胞。易感性KIR基因筛选：应用PCR-SSP技术进行KIR基因分型分析。2.外周血单个核细胞CD158f的检测：首先分离外周血PBMC,10μl抗人CD3抗体,10μl抗人CD16/56抗体,10μ1抗人CD158航体对PBMCs染色,同时设同型对照。3.NK细胞杀伤功能检测：根据基因分型结果,抽取研究个体15mL抗凝静脉血,分离外周血单个核细胞,采用免疫磁珠方法分选NK细胞,流式细胞术测定其纯度。用LDH杀伤试剂盒K562细胞作为靶细胞进行NK细胞杀伤功能检测,根据OD值计算NK细胞杀伤活性。[结果]1.肺结核合并乙肝患者组CD3-CD16/56+的NK细胞上CD158f的表达率比正常对照人群高,差别有统计学意义(12.18±2.58%vs.6.76±2.11%,P<0.001).2.NK细胞杀伤活性在两组(CD158+和CD158-)中有差别,可能与HLA Ⅰ类分子表达无关,因为K562细胞表面不表达HLA Ⅰ类分子。3.外周血NK细胞对K562细胞具有一定的杀伤作用。不同效靶比杀伤活性不同。[结论]1.肺结核合并乙肝患者外周血CD158f的表达率比正常对照人群高。2.肺结核合并HBV患者外周血NK细胞对K562细胞有一定的杀伤作用,不同个体对靶细胞不同效靶比之间NK细胞的杀伤活性有显著性差异：NK细胞对靶细胞的杀伤效应与其KIR的基因型、表型均有一定的相关性。