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目的: 通过建立慢性化学性癫痫大鼠模型,检测定痫丸对癫痫大鼠的发作潜伏期、发作级别、脑电波能量变化以及免疫组化检测即刻早期基因c-foS的表达情况,并通过转录组学分析,探讨了定痫丸抗慢性癫痫发生发作的分子机制。 方法: 采用亚惊厥剂量(35 mg/kg)PTZ腹腔连续注射28天,构建化学点燃慢性癫痫模型,将其随机分组为:CTRL组、丙戊酸钠组、定痫丸高剂量组、中剂量组、低剂量组、中西医结合组。定痫丸干预疗程为28天,分别在干预的第7、14、21、28天用PTZ再次点燃,观察定痫丸对大鼠惊厥发作的治疗效果;于定痫丸干预治疗28天后,在高剂量组、丙戊酸钠组、CTRL组大鼠的海马CA1区植入12通道电极,通过多通道电生理记录系统记录各组大鼠清醒状态和癫痫发作时的局部场电位及脑电波能量变化;运用Morris水迷宫定位航行实验比较定痫丸干预组大鼠与对照组在空间学习记忆能力方面和大鼠游泳轨迹总长度的差异;通过免疫组化染色,检测定痫丸对癫痫大鼠脑内皮层即刻早期基因c-fos表达量的影响;基于转录组学Heatmap、GO和Kegg Pathway分析,初步探讨了定痫丸抗慢性癫痫发生发作的分子机制。 结果: (1)在定痫丸干预第7天,各组大鼠的发作潜伏期无明显差异;在第14、21、28天定痫丸高剂量组大鼠癫痫发作的潜伏期较CTRL和VPA组显著延长,中剂量组在第14天较CTRL、VPA组的潜伏期明显延长,但低剂量组与CTRL、VPA组相比,大鼠发作潜伏期在各时间点检测均无明显差异。各组大鼠在第7天的癫痫大发作比例均在40%-50%之间,随着定痫丸干预时间的延长,高剂量组、VPA组和低剂量组的大发作比例在第14天、21天和28天呈显著下降趋势;中剂量组大鼠的大发作比例在各时间点均未发生显著的改变。 (2)定痫丸对癫痫大鼠脑电的调制效应:各组大鼠在正常清醒状态下,局部场电位水平基本处于同一能量阶层,当给予亚惊厥剂量PTZ诱发后,各组大鼠海马区局部场电位均明显增强,高剂量组和VPA组局部场电位的能量幅度变化低于CTRL组;分离四种不同频率的脑电波α、β、δ、θ进行统计,各组大鼠在清醒状态下四类脑电波的能量均无显著性差异。当给予PTZ亚惊厥诱发后,CTRL组的四类脑电波的能量显著增加,定痫丸高剂量组α、δ、θ和CTRL比较脑电波活动均明显减弱; (3)定痫丸对癫痫大鼠认知功能的影响:定痫丸干预治疗28天后Morris水迷宫实验,高剂量组与VPA组大鼠的逃避潜伏期时间和大鼠游泳路径与CTRL相比显著减少,中剂量、低剂量逃避潜伏期时间与CTRL组相比无明显减少; (4)定痫丸对癫痫大鼠大脑皮层c-los表达量的影响:冰冻切片免疫组化显示, (5)定痫丸高剂量组和VPA组大脑皮层c-fos阳性细胞表达量和CTRL组、低剂量组相比显著降低; (6)定痫丸干预慢性癫痫的分子机制:转录组学分析显示,定痫丸干预组与对照组的差异性表达基因(表达量2倍以上差异)共有57个,其中Egr3、Nrg、Arc和Ptgs2等10个基因与癫痫发生过程密切相关;基于GO和Pathway分析,差异性表达基因主要参与的细胞功能为突触可塑性、受体结合、氧化还原和递质分泌等、信号通路为MAPK-ERK、JAK-Stat、GABA受体合成等; (6)此外,我们还研究了定痫丸高剂量+VPA组成的中西医结合组对癫痫模型的干预,在干预的第7天,各组别大鼠的发作潜伏期无明显差异;在第14、21、28天定痫丸高剂量+VPA组大鼠癫痫发作的潜伏期较CTRL和VPA组显著延长。各组大鼠在第7天时的癫痫大发作比例均在40%-45%之间,随着干预时间的延长,VPA组的大发作比例在第14天、21天和28天呈显著下降趋势;定痫丸高剂量+VPA组、CTRL组大鼠的大发作比例在各时间点均未发生显著的改变。定痫丸高剂量+VPA组干预治疗28天后水迷宫实验,定痫丸高剂量+VPA组与VPA组大鼠的逃避潜伏期时间和大鼠游泳路径长度与CTRL相比显著减少。免疫组化显示:定痫丸+VPA组和VPA组大鼠脑内皮层c-fos表达含量和CTRL组别相比较显著减少。 结论: 定痫丸对PTZ慢性致痫大鼠惊厥发作有明显的缓解作用;对致痫大鼠的海马神经元异常放电有显著抑制效应;定痫丸干预治疗有效改善癫痫模型的空间学习记忆能力;定痫丸通过Egr3-GABRA4信号、NRG1-ErbB4信号以及MAPK-ERK-Arc等通路干预癫痫发生与认知功能障碍;定痫丸+VPA对PTZ慢性致痫大鼠惊厥发作潜伏期影响也有明显缓解作用,可有效改善癫痫模型的学习记忆能力。