论文部分内容阅读
促进肿瘤细胞凋亡同时增强免疫细胞特异性的杀瘤活性是所有肿瘤治疗的根本目的。目前研究发现细胞凋亡信号的传导主要通过两条信号途径来完成,其一为细胞色素C线粒体途径,其二为死亡受体途径。FasL是典型的死亡分子,FasL与死亡受体Fas结合后将诱导Fas阳性细胞发生凋亡。一般认为Fas基因在体细胞中普遍表达而FasL基因的表达受到严格的调控,主要表达在少数免疫特赦部位和激活的成熟T淋巴细胞表面,在肿瘤免疫中被认为是肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)杀伤肿瘤细胞的重要功能分子,中和FasL将抑制抗肿瘤的细胞免疫。但是最近的一些研究却发现肿瘤细胞表面FasL特异性的高表达,对其生物学功能的研究将促进人们对肿瘤生物学行为的进一步理解。我们采用免疫组织化学染色法和反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)在手术切除的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)标本中检测到FasL蛋白和mRNA特异性的高表达。FasL对肿瘤细胞生长是否起调控作用,亦或是肿瘤所处的微环境调控FasL的表达和功能?中和FasL对肿瘤的细胞免疫能力有何影响?对于这些问题的回答将有助于我们进一步理解FasL在肿瘤生物学行为中的作用,鉴于目前尚缺乏相关研究我们针对上述问题进行了一系列实验研究,实验内容概括为以下几个方面。1.FasL mRNA和蛋白在NSCLC中的表达采用RT-PCR法和免疫组织化学染色法对40例手术切除的NSCLC标本进行了检测,结果发现NSCLC中FasL在转录水平和蛋白质水平均存在特异性的高表达。在肿瘤组织中FasL mRNA的阳性表达率为77.5%而正常对照组中为10.0%,两者相比差别非常显著(p<0.01)。FasL蛋白主要表达于肿瘤细胞膜表面和胞浆中,在瘤团外周的肿瘤细胞表达尤为显著。FasL蛋白在肿瘤组织中的平均阳性表达百分数为62.7+29.1%,其中阳性表达百分数在10%以上者37例(占92.5%),60%以上者26例(占65.0%),80%以上者19例(占47.5%),而在正常对照组织中仅在3例重度吸烟者的正常支气管管腔被覆上皮细胞中检测到FasL阳性表达,两者相比差别非常显著(p<0.01)。此外在肺腺癌中FasL蛋白阳性表达百分数为74.3±21.8%而在肺鳞中FasL蛋白阳性表达百分数为54.9±31.1%,两者相比差别显著(p<0.05)。但不同pTNM国际分期和分化程度的肺<WP=13>癌组织中FasL mRNA或蛋白表达无显著差别(P>0.05)。2.中和FasL对NSCLC细胞活性的影响由于早已发现Fas表达于肺癌细胞表面因此我们推测肺癌细胞中可能存在由FasL诱导的自分泌或旁分泌凋亡。为验证这种凋亡途径是否确实存在以及肿瘤内部微环境对FasL蛋白功能的影响我们用体外培养的肺癌细胞进行了实验。我们的体外实验在肿瘤细胞培养液中加入NOK-1(浓度范围0.375μg/ml~6μg/ml)后采用MTT法检测肿瘤细胞活性,结果发现肿瘤细胞的活性无明显改变(p>0.05)。3.中和FasL对TIL杀瘤活性的影响为验证肿瘤细胞所表达的FasL蛋白能否作为肿瘤治疗的新靶点,我们以体外实验的方式模拟了不同的过继免疫治疗(adoptive immune therapy,AIT)方案。A组-模拟常规AIT,B组-同时中和肿瘤细胞和TIL表面FasL情况下的AIT和C组-特异性中和肿瘤细胞表面FasL后的AIT,结果发现在肺癌细胞与TIL共同培养的条件下TIL可以经FasL诱导肺癌细胞的凋亡。A组中TIL的平均杀瘤率为17.5±7.8%,B组为12.0±5.5%,与A组相比B组中TIL平均杀瘤率显著下降(P<0.05),并与实验体系中NOK-1浓度显著相关(P<0.05),而C组平均杀瘤率为25.9±7.8%与A组相比显著增加(P<0.05),且与实验体系预处理过程中NOK-1浓度显著相关(P<0.05)。4.NSCLC原位TIL及反应性增生淋巴结的超微结构的观察透射电镜对8例NSCLC组织及相应的反应性增生区域淋巴结进行了超微结构的观察,这8例肿瘤组织同时也是体外实验培养肿瘤细胞的来源组织,结果发现在肿瘤原位TIL与肿瘤细胞的关系可以概括为三种类型:⑴.TIL与肿瘤细胞之间细胞膜彼此接触,肿瘤细胞胞膜完整呈活跃增生状态,TIL则呈静止状态。⑵.TIL与肿瘤细胞之间细胞膜彼此接触,细胞膜相互融合,此时淋巴细胞呈活跃表现,体积增大,细胞膜表面伸出较多伪足,细胞核内常染色质增多,而肿瘤细胞表现出某些生长受抑的表现,如细胞核较为凝聚,细胞器较少;⑶. TIL与肿瘤细胞之间未能直接接触而是相隔一定距离,瘤细胞呈活跃状态而TIL仍然呈静止状态。本组实验观察到TIL与肿瘤细胞之间的关系大多属于第1和第3种情况。而反应性增生淋巴结中淋巴细胞大多处于激活状态。由以上结果我们认为:⑴. FasL在人类NSCLC中特异性的高表达,其蛋白表达在瘤团中的分布方式有利于肿瘤细胞反杀伤TIL维持瘤团内部相对稳定的微环境;⑵.在体外培养的肺癌细胞群内部肿瘤细胞表达的FasL蛋白不能诱导肿瘤细胞发生自分泌或旁分泌凋亡,肿瘤细胞在此种情况下抵抗FasL诱导的细胞凋亡,但在与TIL共<WP=14>同培养的条件下肿瘤细胞则对FasL诱导的凋亡敏感。⑶.特异性的中和肺癌细胞表达的FasL蛋白可显著提高TIL的杀瘤活性,但同时中和TIL表达的FasL蛋白则显著抑制TIL的杀瘤活性。特异性的下调肿瘤细胞表达FasL将是保护免疫细胞、提高抗肿瘤免疫能力的新的作用靶点。⑷.在肺癌间质中TIL大多处于免疫