目的:阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种以进行性认知功能障碍和记忆损伤为主要临床表现的中枢神经系统退行性病变。β-淀粉样肽（β-amyloid,Aβ）沉积被公认为AD的核心发病机制。内质网作为合成蛋白质的细胞器,其功能改变对细胞产生深刻影响,内质网应激反应导致蛋白质构象功能障碍,导致过多的Aβ形成,从而引发一系列的病理改变。因此内质网对阿尔茨海默病的发病起着重要影响。内质网应激后的未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）激活是对细胞的保护反应;过度的内质网应激或内质网应激机制的异常与AD神经系统损害有关。星形胶质细胞是神经组织中除神经元以外的另一大类细胞且数量最多,在神经退行性疾病中承担重要角色,任何抑制星形胶质细胞异常变化都有利于神经退行性疾病的治疗。孕酮（progseteron,PROG）作为神经甾体具有神经保护作用,但在阿尔兹海默病中孕酮对内质网应激的作用尚不明确,其中研究最多的是孕酮膜结合蛋白1（progesterone receptor membrane component 1,PGRMC1）,其可能在神经系统发挥神经保护作用。本研究使用Aβ_1-42诱导星形胶质细胞内质网应激检测内质网应激的相关蛋白葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78,GRP78）,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（PKR-like ER kinase,PERK）,磷酸化真核起始因子2的α亚单位（eukaryotic initiation factor 2 kinase,e IF2α）,并阐述神经甾体孕酮以及PGRMC1对内质网应激的影响及对PI3K/Akt/GSK3β信号通路的作用。方法:1细胞培养1.1大鼠大脑星形胶质细胞原代培养取新生24h内的SD大鼠,消毒后,取大脑皮质部分,用镊子剥去脑膜,剪碎,37℃水浴中胰酶消化15-20 min,含10%FBS的高糖DMEM终止消化。使用巴氏吸管慢慢吹打细胞,制成单细胞悬液,接种于培养瓶中,培养瓶提前用多聚赖氨酸包被。细胞密度为1.0×106/L。37℃,5%CO2细胞培养箱中孵育,24 h后首次半量更换培养液,以后每隔2-3 d进行全量更换培养液。使用“二次震荡法”纯化星形胶质细胞,使星形胶质细胞纯度超过95%,纯化后重新接种于六孔板中,培养备用。2 Aβ_1-42寡聚1 mg Aβ_1-42溶于六氟异丙醇（Hexafluoroisopropanol,HFIP）中,使之溶解然后分装,分装后在通风橱中将HFIP挥发干得Aβ肽膜,-20℃保存。用前用DMSO溶解肽膜,DMEM培养基稀释至100μM,4℃放置24 h,即得到Aβ寡聚体。3 GFAP标记免疫荧光染色观察星形胶质细胞的形态通过对GFAP（星形胶质细胞特异性中间纤维蛋白）免疫荧光染色,观察星形胶质细胞的形态。取出细胞爬片,4%多聚甲醛固定30 min,兔源GFAP（1:1000）4℃孵育过夜,二抗孵育1 h,荧光显微镜下观察。4实验分组与给药4.1 Aβ_1-42对星形胶质细胞内质网应激的影响星形胶质细胞经Aβ_1-42处理不同时间,随机分为Control、Aβ（2 h）、Aβ（4 h）、Aβ（8 h）四组处理,行Western blot检测GRP78蛋白水平变化,其中Aβ_1-42浓度为1μM。4.2孕酮对星形胶质细胞增殖的影响取星形胶质细胞随机分为Control、PROG（1μM）、Aβ_1-42（1μM）、Aβ_1-42+PROG处理组,行MTT细胞活性检测。4.3孕酮对星形胶质细胞内质网应激的影响取星形胶质细胞随机分为Control、PROG、Aβ_1-42、Aβ_1-42+PROG,Western blot检测GRP78、p-PERK、p-e If2α蛋白水平变化。4.4孕酮对Aβ_1-42所致星形胶质细胞内质网应激的机制研究4.4.1取星形胶质细胞随机分为Control、Aβ_1-42、Aβ_1-42+PROG、Aβ_1-42+Li Cl（GSK3β抑制剂,10 m M）,Western blot检测GRP78、p-GSK3β蛋白水平变化。4.4.2取星形胶质细胞随机分为Control、Aβ_1-42、Aβ_1-42+PROG、Aβ_1-42+PROG+LY294002（PI3K/Akt通路抑制剂,10μM）,Western blot检测GRP78、p-Akt、p-GSK3β蛋白水平变化。4.4.3取星形胶质细胞随机分为Control、Aβ_1-42、Aβ_1-42+PROG、Aβ_1-42+PROG+AG205（PGRMC1抑制剂,10μM）,Western blot检测GRP78、p-PERK、p-e If2α、p-Akt、p-GSK3β蛋白水平变化。5 MTT法检测细胞存活率取出加药处理后的细胞爬片,放入24孔板中,每孔加入40μL MTT（5 mg?m L-1）,于37℃孵育4 h,弃去培养基,每孔各加入300μL DMSO,混合均匀,酶标仪测定各组细胞490 nm波长处的吸光度（OD值）,以各组细胞吸光度与对照组吸光度的比值表示相对细胞存活率。6 Western Blot检测GRP78、p-PERK、p-e If2α、p-Akt、p-GSK3β表达收集细胞,提取细胞总蛋白,测定蛋白浓度后煮沸变性,电泳分离蛋白,转膜,封闭,孵育一抗GRP78、p-PERK、p-e If2α、p-Akt、p-GSK3β（1:1000）过夜,室温孵育二抗,暗室中显影。结果经凝胶成像分析系统分析扫描,测定各条带积分光密度,以目的蛋白与β-actin积分光密度值的比值表示。7.数据处理与统计分析以上实验均重复三次,结果以均数±标准差（mean±SD）表示,应用SPSS 16.0统计软件,采用单因素方差分析（one way ANOVA）继以Dunnett t test对数据进行统计分析。结果以P<0.05视为差异有统计学意义。结果:1 Aβ_1-42诱导星形胶质细胞产生内质网应激GFAP标记的免疫荧光染色,观察星形胶质细胞的形态。荧光显微镜下可见,星形胶质细胞胞体饱满,扁平,胞浆丰富。Western Blot结果显示:与对照组相比,用1μM Aβ_1-42处理星形胶质细胞4 h,GRP78的表达显著升高（P<0.05）,说明1μM Aβ_1-42处理4h星形胶质细胞产生内质网应激。2孕酮对星形胶质细胞增殖的影响MTT结果显示,与对照组相比,1μM Aβ_1-42作用于星形胶质细胞4 h后,细胞的存活率为对照组的（78.9±2.64）%（P<0.05）。与单加Aβ_1-42组比较,1μM孕酮与Aβ_1-42共同处理4 h,显示出明显的保护作用,细胞存活率为单加Aβ_1-42组的（120.0±1.73）%（P<0.05）。3孕酮对Aβ_1-42诱导星形胶质细胞内质网应激的影响Western Blot结果显示:与对照组相比,Aβ_1-42诱导的模型组中GRP78、p-PERK和p-e If2α表达水平显著升高（P<0.05）。与模型组比较,PROG保护组GRP78、p-PERK和p-e If2α表达水平显著下降（P<0.05）;其中单加孕酮组GRP78、p-PERK和p-e If2α表达水平与对照组比较无统计学差异（P>0.05）。4孕酮通过下调GSK3β减轻Aβ_1-42诱导星形胶质细胞内质网应激Western Blot结果显示:与对照组相比,Aβ_1-42诱导的模型组中GRP78和p-GSK3β表达水平显著升高（P<0.05）。与模型组比较,PROG保护组GRP78和p-GSK3β表达水平显著下降（P<0.05）;Li Cl（10 m M）处理组GRP78和p-GSK3β表达水平显著下降（P<0.05）。5孕酮通过PI3K/Akt信号通路调控星形胶质细胞内质网应激Western Blot结果显示:与对照组相比,Aβ_1-42诱导的模型组中GRP78和p-GSK3β表达水平显著升高（P<0.05）,p-Akt表达水平显著降低。与模型组比较,PROG保护组GRP78和p-GSK3β表达水平显著下降（P<0.05）,p-Akt表达水平显著升高（P<0.05）。与孕酮保护组相比,LY294002处理组GRP78和p-GSK3β表达水平显著上升（P<0.05）,p-Akt表达水平显著下降（P<0.05）。6孕酮部分通过PGRMC1调控星形胶质细胞GRP78、PERK和e If2α表达Western Blot结果显示:与Aβ_1-42诱导的模型组比较,孕酮保护组GRP78、p-PERK和p-e If2α表达水平显著下降（P<0.05）;与孕酮保护组相比,AG205处理组GRP78、p-PERK和p-e If2α表达水平显著上升（P<0.05）。7孕酮部分通过PGRMC1调控星形胶质细胞Akt和GSK3β表达Western Blot结果显示:与Aβ_1-42诱导的模型组比较,孕酮保护组p-Akt表达水平显著上升（P<0.05）,p-GSK3β表达水平显著下降（P<0.05）;与孕酮保护组相比,AG205处理组p-Akt表达水平显著下降（P<0.05）,p-GSK3β表达水平显著上升（P<0.05）。结论1 Aβ_1-42能够诱导星形胶质细胞产生内质网应激2孕酮通过影响内质网应激相关蛋白GRP78、PERK和e If2α的表达减轻Aβ_1-42诱导的星形胶质细胞内质网应激。3孕酮可能通过PI3K/Akt/GSK3β信号通路抑制Aβ_1-42诱导的星形胶质细胞内质网应激。4孕酮部分通过PGRMC1调控星形胶质细胞相关蛋白进而抑制Aβ_1-42诱导的星形胶质细胞内质网应激。