第一部分:放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8⁺T细胞浸润的作用及机制研究背景:近年来的研究发现,肿瘤免疫治疗的疗效在很大程度上取决于肿瘤内CD8⁺T细胞的浸润程度和肿瘤微环境（TME）的状态。放疗可促进肿瘤免疫微环境的炎症反应从而增强CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤反应,因此其可能作为免疫治疗的重要的辅助手段。已有大量证据证实放疗可诱导肿瘤局部I型干扰素介导的免疫微环境改变,然而其诱导的全身性的免疫调节作用仍有待探索。因此,进一步深入阐明放疗对肿瘤免疫微环境的影响,对探索放疗与免疫治疗的联合具有重要意义。在多种动物模型中,我们观察到放疗（RT）通过重塑肿瘤微环境使其利于嗜酸性粒细胞招募,而这种招募作用与CD8⁺T细胞浸润增强密切相关。当用抗体清除嗜酸性粒细胞后放疗诱导的CD8⁺T细胞浸润减少,而对肿瘤的控制也被明显削弱,说明放疗诱导的嗜酸性粒细胞增多对于T细胞介导的抗肿瘤作用不可或缺。在对接受过放疗的肿瘤患者进行回顾性分析时我们也发现了嗜酸性粒细胞和CD8⁺T细胞之间的相关性。利用动物模型我们证实放疗分别增强了回输的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的瘤内浸润。这一现象与临床实践不谋而合,在一例淋巴瘤患者接受CD19CAR-T细胞治疗的过程中我们发现放疗促进了CAR-T细胞浸润,并缩短了治疗起效时间,延长了患者受益持续时间。综上所述,基于我们的动物和临床发现,放疗引起的嗜酸性粒细胞增多可作为参考预测患者的治疗疗效,甚至提供增强T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗的新策略。方法:1.放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）建立C57BL/6小鼠的黑色素瘤荷瘤模型（B16-F10）,并对肿瘤进行局部放疗（20Gy）,放疗后第7天取肿瘤组织进行RNA-Seq检测及GSEA分析。检测内容包括:炎症信号,粒细胞活性,粒细胞免疫信号。（2）取放疗后第7天的肿瘤组织,通过流式细胞术检测肿瘤内免疫细胞亚群变化。检测内容包括:CD45阳性淋巴细胞,DC细胞,NK细胞,嗜酸性粒细胞,CD4⁺T细胞,CD8⁺T细胞,单核细胞,中性粒细胞,Ly6C^hi细胞。（3）建立小鼠B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,一侧肿瘤接受局部20Gy放疗,另一侧不做处理。之后将CFSE标记的活化的嗜酸性粒细胞回输到受辐射小鼠体内,48小时后取肿瘤组织,进行流式细胞术检测双侧肿瘤中CFSE阳性嗜酸性粒细胞。（4）利用Transwell方法检测经放射的肿瘤组织对嗜酸性粒细胞的趋化作用。（5）PCR检测经放射肿瘤组织中与嗜酸性粒细胞趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。2.细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。（1）在B16-F10黑色素瘤动物模型中,对肿瘤进行局部放疗（20Gy）或不处理,PCR检测两组肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关的因子的mRNA表达水平。流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8⁺T细胞的相关性。（2）建立4T1乳腺癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8⁺T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。（3）建立MC38结肠癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8⁺T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）统计嗜酸性淋巴肉芽肿患者外周血中嗜酸性粒细胞数量,免疫组化检测手术标本中嗜酸性粒细胞的数量,分析外周血与组织浸润嗜酸性粒细胞数量的一致性。（2）收集整理既往接受过放疗的非小细胞肺癌患者（NSCLC）234例,统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作相关分析。（3）收集整理既往接受过放疗的鼻咽癌患者（NPC）249例。统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作分析。4.嗜酸性粒细胞在CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）采用anti-Siglec-F抗体清除荷瘤小鼠体内的嗜酸性粒细胞,流式细胞术检测清除效果。（2）流式细胞术检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内的CD8⁺T细胞及效应性CD8⁺T细胞的比例,并与嗜酸性粒细胞做相关性分析。（3）PCR检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内小鼠肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA信号。（4）嗜酸性粒细胞清除后测量小鼠的肿瘤体积变化情况。5.嗜酸性粒细胞浸润可促进过继免疫治疗的疗效。（1）利用B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,通过尾静脉回输Pmel活化的CD8⁺T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中Pmel阳性CD8⁺T浸润情况。（2）建立NPG小鼠双侧荷瘤模型,尾静脉回输CAR-T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中CAR-T浸润情况。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）监测入组临床试验的患者疾病进展。（2）整理患者血常规信息。（3）肿瘤局部穿刺样本检测。结果:1.放疗可促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）RNA-Seq结果提示,放疗后肿瘤组织内活性氧通路、I型干扰素信号、γ干扰素信号及炎症反应信号通路明显增强。其中,关于粒细胞趋化、迁移及活化的基因富集程度明显升高。（2）放疗后肿瘤浸润多种免疫细胞比例增多,其中CD8⁺T细胞及嗜酸性粒细胞增加明显。（3）双侧荷瘤模型中,与未处理侧肿瘤相比,经放射侧肿瘤内CFSE阳性嗜酸性粒细胞浸润明显增加。（4）体外实验发现,与对照组相比,放射处理的肿瘤组织招募嗜酸性粒细胞的能力更强。（5）PCR检测发现放疗后嗜酸性粒细胞趋化和生存相关的因子表达明显升高。2.嗜酸性粒细胞的浸润与细胞毒性T淋巴细胞的招募密切相关。（1）PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关分子的mRNA表达明显增高。流式细胞术检测发现小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的比例与CD8⁺T细胞及效应CD8⁺T细胞的比例均高度相关。（2）在4T1乳腺癌动物模型中,流式细胞术检测也发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8⁺T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8⁺T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。（3）在MC38结肠癌动物模型中,流式细胞术检测也同样发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8⁺T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8⁺T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）非小细胞肺癌患者中,外周血中的嗜酸性粒细胞数量与肺癌组织免疫组化染色计数高度相关,提示外周血中嗜酸性粒细胞的数量可用来预测肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的浸润程度。（2）非小细胞肺癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高,且升高倍数为1.67倍或者2倍以上的患者无进展生存期更长。（3）在鼻咽癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量也明显升高,且升高倍数为2倍或者2.20倍以上的患者无进展生存期更长。4.嗜酸性粒细胞在CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）流式细胞术检测证明anti-Siglec-F抗体有效的清除了小鼠体内的嗜酸性粒细胞。（2）嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤浸润CD8⁺T细胞及效应性CD8⁺T细胞的比例都明显降低,且与嗜酸性粒细胞的比例高度相关。（3）PCR检测发现嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA表达明显降低。（4）嗜酸性粒细胞清除削弱了放疗对小鼠肿瘤生长的控制。5.嗜酸性粒细胞可促进过继免疫治疗的疗效。（1）B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的Pmel CD8⁺T细胞的比例和数量明显增多。（2）Raji淋巴瘤NPG小鼠双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的CAR-T细胞明显增多,且CAR-T细胞与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）一例恶性淋巴瘤患者中,放疗联合CAR-T回输治疗延缓肿瘤复发。（2）放疗后该患者外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高。（3）PCR检测肿瘤穿刺样本发现,放疗侧肿瘤内CAR-T细胞浸润明显高于非放疗侧。结论:放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。嗜酸性粒细胞在CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。放疗可促进过继免疫治疗的疗效。放疗可增强恶性淋巴瘤患者CAR-T细胞免疫治疗的疗效。第二部分:肿瘤局部的突变多样性引起了免疫的异质性背景:肿瘤是一种遗传性疾病,肿瘤细胞的生长是由激活致癌因子的突变引发的。这一过程也涉及到遗传性或非遗传性促癌基因的激活或抑癌基因的失活。在多种癌症中,肿瘤的发生伴随着突变的积累,突变的积累可以通过增加肿瘤细胞的遗传多样性程度,加速肿瘤细胞的进化适应性,从而为肿瘤细胞群提供选择性优势。然而,这种遗传多样性是有代价的:肿瘤细胞相较于正常细胞分化程度越高,越容易被免疫系统识别为异体细胞。虽然长期以来人们一直认同这种可能性的存在,但直到最近几年才证实肿瘤的总突变负荷（TMB）有助于癌症的免疫识别,而且它可能在一定程度上决定个体对抗肿瘤免疫治疗的反应。结合全外显子组测序、转录组分析和T细胞库分析,我们选取了15例非小细胞肺癌（NSCLC）患者手术切除肿块的多位点组织进行空间特征分析。结果表明肿瘤组织的免疫微环境具有高度的空间异质性,瘤内区域差异与个体间差异一样大。虽然局部总突变量与局部T细胞克隆扩增有关,但局部抗肿瘤细胞毒性与新抗原丰度没有直接关系。综上所述,这些发现提醒我们,免疫学特征不应该仅通过TMB或单位点活检的微环境分析来预测。方法:我们招募了15名新诊断的非小细胞肺癌患者,对于每个从原发肿瘤肿块中采集的多个活检样本,我们进行了多种基因组和免疫原性的基因组分析,包括全外显子组测序（WES）、转录组分析（RNA-seq）和T细胞库测序。为了进一步提高肿瘤免疫微环境评估的准确性,我们开发了一种机器学习方法,将多维免疫相关变量集成起来进行数据挖掘。通过使用一种随机森林算法,输入278个变量将肿瘤位点的免疫微环境分类为“热”肿瘤区域和“冷”肿瘤区域。结果:1.突变负荷与T细胞扩增相关2.突变负荷与细胞毒性不相关3.肿瘤微环境存在空间异质性4.突变异质性与免疫异质性相关结论:瘤内区域间的免疫微环境存在高度的空间异质性,需要综合全面地评价TME免疫表型。