禽白血病（Avain leukosis,AL）是由禽白血病病毒（Avain leukosis virus,ALV）引起的免疫抑制性疾病,尤其对鸡的危害最大。病毒可以水平或者垂直传播,根据抗体中和实验,可以将病毒分为11个亚群,其中,有7个亚群可感染鸡,分别是A～E、J和K型。目前,尚无有效疫苗和药物用于预防该病,所以,净化鸡群是最主要的防控方式。建立针对不同需求的净化方式,是净化该病的首要任务。快速便捷的检测方法对于ALV的防控与净化有着重要意义。本实验以安徽地区分离到的A和J亚群ALV,主要进行了两个方面的研究。第一,建立同时检测A、J和通用型ALV的三重PCR方法,临床检验效果良好。首先,从NCBI基因库中获得A和J亚群的gp85和所有亚群的pol基因序列,应用Oligo 7.0软件分别设计3对A和J亚群引物和2对通用型引物。以安徽省分离的A和J亚群ALV进行引物的验证和筛选;其次,回收扩增到的三个目的基因片段连接至p MD18-T中构建重组质粒,对PCR方法进行优化进而建立三重PCR检测方法,再对建立的方法进行敏感性和重复性检验;最后,以建立的方法对临床收集的43份样品进行检测并与标准化试剂盒的检测结果进行比对。结果显示,所设计的引物序列特异性和保守性强,均能扩增获得特异性PCR条带,最后筛选的A、J和通用型引物的目的片段大小分别为274 bp、338 bp和145 bp。建立的三重PCR方法最低可以检测模板的浓度为1×10~3拷贝/μL,无非特异性扩增,且重复性良好。临床样品检测结果发现所建立的方法对样品检测的阳性率为83.7%,与标准化试剂盒的检测率的符合率为92%。这说明本次建立的方法特异性强,灵敏度高且成本低廉,适合不同规模鸡场的定性检测使用。第二,建立同时检测A和J亚群ALV的双重荧光探针法,检测灵敏度和精确度极高。首先,针对A和J亚群病毒的gp85基因序列应用Oligo 6.0和Oligo 7.0软件设计双重荧光定量PCR的引物与探针。其次,设计和合成扩增区域的重组质粒,使用设计的引物建立标准曲线,优化反应条件,并应用探针进行灵敏度和稳定性检验。最后,应用设计的引物和探针对临床的20份样品进行检测。结果显示,应用软件设计的A和J亚型的引物和探针分别为TQ-ALV-A-F、TQ-ALV-A-R和TQ-ALV-A-probe,TQ-ALV-J-F、TQ-ALV-J-R和TQ-ALV-A-probe,分别可扩增出177 bp和102 bp大小的条带。建立的双重荧光探针法的敏感度A型最低可检测到13拷贝/μL,J型最低可检测到71拷贝/μL。重复性检验显示各组内变异系数均小于1%。这说明本次建立的双重荧光探针方法特异性和灵敏度极高,重复性极好,可以用于各种鸡场的定型和定量检测。总之,本次研究以临床中分离到的A和J亚型ALV毒株,建立了同时检测ALV的三重PCR方法和同时检测A和J亚群的双重荧光探针方法,临床检测特异性和灵敏度均较高,为临床中ALV净化提供不同的使用方法。