第一部分SD大鼠乳鼠心肌细胞原代培养、CVB3感染心肌细胞模型的建立 目的：成功建立病毒性心肌炎病毒直接感染心肌细胞的体外模型，为进一步从心肌细胞分子生物学和病理学的角度，探讨病毒性心肌炎病毒损伤阶段的发病机理奠定基础。 方法：以柯萨奇B3m病毒感染新生SD大鼠的培养心肌细胞，观察感染后细胞病变、搏动情况、并用免疫组化法来确定心肌细胞的纯度，采用RT-PCR方法扩增出CVB3的特异性条带。 结果：培养的SD大鼠搏动心肌细胞经α-actin免疫组化染色后确定其纯度达到95％以上，感染柯萨奇B3病毒后，逐步出现了细胞病变，细胞停止搏动，心肌细胞培养上清液中肌酸激酶(CK-MB)的含量明显增高，RT-PCR并可以扩增出CVB3特异性条带。 结论：柯萨奇病毒感染心肌细胞的体外模型可以作为体外研究病毒性心肌炎的基础。 第二部分SOCS1基因和显性突变体SOCS1基因绿色荧光表达载体的构建及其在心肌细胞中的瞬时表达 目的：构建SOCS1基因和显性失活突变体SOCS1(dnSOCS1)基因的绿色荧光表达载体，并在心肌细胞中进行表达 方法：现将pcDNA3.0-SOCS1和pcDNA3.0-dnSOCS1两个基因分别用EcoRI和XhoI进行限制性双酶切得到SOCS1和dnSOCS1两目的基因；然后将pEGFP-C1用EcoRI和SalI进行双酶切，得到载体片段，把两个目的基因定向克隆到绿色荧光载体pEGFP-C1中，即构建了SOCS1和dnSOCS1两基因的绿色荧光表达载体pEGFP-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1。然后利用lipofectamine2000转染试剂介导将两基因分别转染到原代心肌细胞。 结果：在原代心肌细胞中成功表达了绿色荧光真核表达载体pEGFP-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1，48小时表达效率达25.20±6.25％。 结论：我们首先构建了SOCS1和显性失活突变SOCS1基因的绿色荧光表达载体pEGFP-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1，利用脂质体将其转染至心肌细胞中并成功的进行了表达，为下一步的研究奠定基础。 第三部分受病毒感染的心肌细胞中SOCS1降低IFNγ诱导的JAK-STAT信号通路敏感性及机制的初步研究 目的：在病毒性心肌炎细胞模型中，观察JAK-STAT信号通路的特异性内源抑制物SOCS1及其显性失活突变体SOCS1(dnSOCS1)对IFN-γ抗CVB3活性的影响。本研究将探索在病毒性心肌炎中SOCS1对IFN-γ信号转导通路的作用，并从IFNγ受体和干扰素诱导产物合成的水平研究其效应改变的机制。 方法：构建pEGFP-C1-SOCS1及pEGFP-C1-dnSOCS1的真核表达载体，以脂质体法转染至心肌细胞后，加用干扰素γ刺激细胞并感染病毒，采用荧光显微镜检测心肌细胞中SOCS1和dnSOC1的表达，同时利用Westernblot法测定不同条件下STAT1,STAT3,JAK1的表达水平并测定病毒滴度，采用RT-PCR方法测定干扰素诱导产物2’，5’-寡腺苷酸合成酶(2,5-OAS)和干扰素γ受体(IFNGR1)mRNA水平。 结果：与转染dnSOCS1组相比，在转染SOCS1组病毒滴度高，而心肌细胞存活率低，心肌细胞搏动时间短，磷酸化STAT1，JAK1的表达很少。而在dnSOCS1组，磷酸化STAT1，JAK1的表达更明显，心肌细胞存活率高，细胞病变少见，干扰素诱导产物2,5-OAS的mRNA表达较高。在转染SOCS1和dnSOCS1组均无STAT3的磷酸化表达，另外，干扰素γ受体和STAT3的水平不变。 结论：在病毒性心肌炎中，干扰素γ激活了JAK1-STAT1通路，同时SOCS1可以抑制干扰素诱导的抗病毒蛋白产物的表达，SOCS1参与了病毒性心肌炎的发生发展过程，可以为我们在治疗病毒性心肌炎中提供一个新的治疗靶点。