研究背景骨性关节炎(osteoarthritis,OA)主要临床表现为关节的慢性疼痛、活动受限和关节肿胀,以关节软骨退变和慢性炎症为主要病理改变。关节软骨退变主要原因是软骨细胞衰老,细胞外基质的降解增加,软骨下的骨硬化导致骨赘形成。随着骨性关节炎进展,受累关节及滑膜炎症激活外周伤害感受器,使伤害性信号传入脊髓,导致脊髓伤害性神经元兴奋性增强,从而造成疼痛的性质和机制发生改变,从伤害性感受进展为神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NP)。OA不仅给患者带来精神和躯体痛苦,也是临床医生面临的严峻挑战。因此,探寻OA的发生机制和治疗OA的有效方法成为临床研究热点。医用臭氧起源于十九世纪末,由Wolff报道臭氧应用于战斗创伤治疗,发挥抗炎杀菌作用。之后意大利Bocci V医生发现医用臭氧具有抗炎、镇痛和促进局部组织再生等作用。由于医用臭氧在临床上具有操作简单、费用低、创伤小等优势,逐渐在世界范围内开始广泛应用。医用臭氧是一种不稳定蓝色气体,是氧的同分异构体,水溶性较O2高10倍,较空气高20倍,极易溶于血液和组织液等。臭氧在常温下迅速分解为O2和具有氧化能力的氧原子,后者与生物分子反应生成的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)和脂质过氧化物(Lipid hydroperoxides,LOPs)产生治疗作用,可用于治疗口腔、皮肤、粘膜感染等。在临床疼痛的治疗中,医用臭氧发挥抗炎、抗氧化和镇痛作用,对腰椎间盘突出症(Lumbar Disc Herniation,LDH)、软组织疼痛、OA等治疗确切,得到医生和患者的认可。已有研究报道低浓度医用臭氧(≤30 μg/mL)的关节腔注射治疗OA,可抑制IL-1β和TNF-α产生,减少软骨细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)降解,对软骨细胞具有保护作用。目前医用臭氧对OA治疗机制和镇痛机制的基础研究甚少,限制了医用臭氧在临床的规范和安全应用。目前研究发现OA的软骨细胞自噬降低是软骨退变的主要原因。维持软骨细胞一定的自噬水平可减缓软骨退变,是软骨细胞生存的重要方式。因此,提高软骨细胞的自噬成为OA的治疗靶点。自噬是维持细胞稳态和生存的重要方式,当应激时,如能量缺乏、氧化应激、低氧环境等,细胞为保护并维持自身的生存,升高自噬水平。自噬相关基因(autophage-related gene,ATG)首次发现于酵母菌中,与之对应的真核细胞基因也随之确定。其中ATG1、ATG6、ATG8分别对应哺乳动物的 Unc-51 样激酶 1(Unc-51-like kinase 1,ULK-1)、Beclin1 和微管相关蛋白 1 轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3),它们是自噬的关键基因,泛素化结合蛋白SQSTM1/p62(p62)也参与自噬的发生。LC3广泛表达于哺乳动物组织和培养的细胞的可溶性蛋白中,称为胞浆型LC3(LC3I)。自噬发生时,LC3I转化为磷脂共轭化合物形式的LC3II。ULK-1是自噬泡形成所必需的,ULK-1激酶的失活抑制LC3II形成,从而抑制自噬发生。ULK-1接受自噬关键调控因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)调节,能量缺乏时mTOR受到抑制,mTOR对ULK-1的抑制作用减弱,ULK-1活性增强,上调细胞自噬。Beclin1基因又叫BECN1基因,Beclin1的表达与自噬水平呈正相关,是自噬的正向调节因子。mTOR可接受上游多条信号通路调节,其中AMP依赖的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/mTOR信号通路受到广泛关注,AMPK负性调控mTOR调节自噬。已有研究证明氧化脂蛋白a通过激活AMPK/mTOR信号通路,提高血管内皮细胞的自噬,且AMPK的激活呈ROS依赖性。目前研究认为AMPK可通过调节关节软骨细胞的mTOR等下游靶分子的活性而提高软骨细胞的生存能力。当关节软骨细胞内AMPK活性下降时,导致关节软骨的退行性变进而进展为OA,AMPK激动剂可缓解动物OA的发生和发展。以上研究结果表明软骨细胞内的AMPK/mTOR信号通路通过调节细胞自噬治疗OA。此外,神经元细胞的自噬也是NP的治疗靶点。脊髓背根神经节(Dorsal Root Ganglion,DRG)细胞的自噬水平上调,能有效缓解外周神经损伤导致的NP。自噬的激活剂雷帕霉素(mTOR抑制剂)通过上调DRG细胞自噬,呈剂量依赖性的缓解大鼠脊神经结扎(Spinal nerve ligation,SNL)模型诱发的NP,发挥长时效的镇痛作用。因此,NP的发生和发展与神经元细胞自噬密切相关,但医用臭氧治疗OA的镇痛机制是否与自噬相关,尚未明确。课题组前期观察研究关节腔内注射不同浓度医用臭氧对大鼠OA的影响,结果表明25 μg/mL和50 μg/mL医用臭氧均能提高OA大鼠的机械痛阈,但25μg/mL医用臭氧可改善关节软骨表面光滑度,提高软骨细胞的数量,软骨细胞中基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)表达也有所下降。体外研究发现低浓度医用臭氧(≤30μg/mL)可抑制OA软骨细胞分泌TNF-α、基质金属蛋白酶-3(Matrix metalloproteinase-3,MMP-3)和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)。以上均证明低浓度医用臭氧对OA具有抗炎、抑制软骨退变和镇痛的作用。因此本研究假设低浓度的医用臭氧对OA的治疗作用可能通过AMPK/mTOR信号通路调节OA软骨细胞自噬,从而抑制炎症因子的释放,平衡软骨细胞的合成和分解代谢,延缓关节软骨退变,并活化脊髓的AMPK发挥镇痛作用。第一部分医用臭氧对大鼠骨性关节炎软骨自噬的影响及镇痛机制研究研究目的本研究建立碘乙酸盐(Monoiodoacetic Acid,MIA)诱导的大鼠OA模型,观察医用臭氧对大鼠OA软骨退变和软骨细胞自噬的影响,观察大鼠脊髓疼痛信号的变化,探讨医用臭氧对OA可能的治疗机制和镇痛机制。研究方法1.实验分组和OA模型的建立。雌性Wistar大鼠随机分为3组:Sham组,右膝关节腔注射生理盐水50 μL;MIA组,右膝关节腔注射50μL MIA(3mg),建立OA模型;MIA+O3组,右膝关节腔注射50μL MIA后的第7、14、21天(d)分别注射30μg/mL医用臭氧0.5 mL。2.大鼠一般行为学观察,机械缩爪阈值(Mechanical Withdrawal Threshold,MWT)和热缩爪潜伏期(Paw Withdrawal Latency,PWL)的测定。观察各组大鼠一般行为学,并分别在MIA注射前1d、注射后1、4、7、14、21、28 d测定大鼠MWT(up-down法,Von Frey Hairs test)和PWL,观察医用臭氧对OA大鼠疼痛行为的影响。3.HE染色和番红-固绿染色(Safranine O-Fast Green Staining)在MIA注射后28 d,行为学测定后麻醉处死,4%多聚甲醛灌注后取大鼠的右膝关节,经过固定、脱钙、石蜡包埋,切片等,然后通过脱蜡、水化、染色、封片等步骤,进行HE染色和番红-固绿染色,并进行Mankin评分,观察医用臭氧对OA软骨退变的影响。4.免疫组织化学法检测软骨自噬相关蛋白MMP-13、collagen 2、LC3II和p62的表达。在MIA注射后28 d,麻醉后处死,4%多聚甲醛灌注后取大鼠的右膝关节,经过固定、脱钙、石蜡包埋,切片等,然后经过脱蜡、水化、抗原修复、封闭、孵育一抗和二抗、DAB显色、苏木素复染、封片,观察MMP-13、collagen 2、LC3II和p62的表达,观察医用臭氧对软骨退变和软骨自噬的影响。5.免疫组织化学法检测大鼠关节软骨和脊髓p-AMPK的表达。在MIA注射后28 d,麻醉后处死,4%多聚甲醛固定后取大鼠的右膝关节和L2-L4脊髓节段,经过固定、脱钙、石蜡包埋、切片等,然后经过烤片、脱蜡、水化、抗原修复、封闭、免疫反应、DAB显色、苏木素复染、封片,观察关节软骨和脊髓p-AMPK的表达,探讨医用臭氧对OA可能的治疗机制和镇痛机制。6.EILSA法测定大鼠的外周血炎症因子TN F-α和IL-6的浓度。在MIA注射后28 d,麻醉后抽取外周血5mL至促凝采血管,3000 rpm离心10 min取上清待测。分别向检测板孔内加入标准品、待测样品和抗体孵育,洗涤后加TMB显色剂,终止剂等步骤,酶标仪检测OD值并计算TNF-α和IL-6的浓度,探讨医用臭氧对OA炎症的影响。研究结果MIA注射后14d、21d和28d,MIA组的MWT和PWL较Sham组显著降低(P<0.01),MIA+O3组MWT和PWL较MIA组显著升高(P<0.01)。HE染色和番红-固绿染色结果证明医用臭氧注射延缓软骨的退变,Mankin评分MIA组显著高于Sham组(P<0.01),MIA+O3组显著低于MIA组(P<0.01)。免疫组织化学结果显示,与MIA组相比,在MIA+O3组软骨中MMP-13表达降低,而collagen 2表达升高(P<0.05)。LC3II在MIA+O3组软骨表达显著高于MIA组(P<0.01),而p62表达低于MIA组(P<0.05)。与Sham组相比,p-AMPK在MIA组软骨中表达显著降低(P<0.01),与MIA组相比,在MIA+03组软骨中表达显著升高(P<0.01)。与Sham组相比,脊髓p-AMPK在MIA组的表达降低(P<0.05),在MIA+03组表达显著升高(P<0.05);与MIA组相比,脊髓p-AMPK在MIA+03组表达显著升高(P<0.01)。与Sham组相比,MIA组IL-6浓度显著升高(P<0.01),TNF-α浓度升高(P<0.05),与MIA组相比,MIA+O3组IL-6浓度显著降低(P<0.01),TNF-α浓度降低(P<0.05),结果证明医用臭氧对OA炎症有一定抑制作用。结论关节腔注射医用臭氧可有效缓解大鼠OA疼痛,降低炎性因子IL-6和TNF-α的浓度,抑制MMP-13表达和collagen 2的降解,上调软骨细胞自噬相关蛋白LC3II而抑制p62表达,延缓软骨退变。该作用除与上调OA软骨细胞自噬相关外,可能还与激活脊髓AMPK有关。第二部分医用臭氧通过AMPK/mTOR信号通路调节IL-1 β诱导的软骨细胞的自噬研究目的本研究体外培养IL-1β诱导的原代大鼠软骨细胞,医用臭氧干预后观察医用臭氧对IL-1β诱导的软骨细胞自噬和功能等方面的影响,探究医用臭氧对IL-1β诱导软骨细胞的作用机制。研究方法1.大鼠的原代软骨细胞提取、培养和鉴定。2.CCK-8法检测不同浓度医用臭氧对IL-1β诱导的软骨细胞存活能力的影响,自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3MA)和AMPK抑制剂compound C对IL-1β诱导的软骨细胞存活能力影响。3.免疫印迹法(Western Blotting)和细胞免疫荧光(Immunofluorescence)技术检测医用臭氧对IL-1β诱导的软骨细胞的自噬相关蛋白LC3II和p62的影响。4.quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR)检测炎症因子 TNF-α 和 IL-6 以及MMP-13和TIMP-1 mRNA表达变化,观察医用臭氧对IL-1β诱导的软骨细胞炎症和退变的影响。5.免疫印迹法(Western Blotting)检测AMPK/mTOR信号通路、自噬调节分子Beclin-1、ULK-1和凋亡蛋白Bcl2/Bax表达变化,探讨医用臭氧对IL-1β诱导的软骨细胞的自噬调节是否通过AMPK/mTOR信号通路介导。6.透射电镜观察医用臭氧对IL-1β诱导的软骨细胞的自噬小体的影响。研究结果1.大鼠的原代软骨细胞的生长情况和鉴定。倒置相差显微镜下观察发现,培养24 h后的细胞呈三角形、四边形和多角型,继续培养2-3 d,细胞生长融合至70-80%左右,呈现鹅卵石样外观。collagen 2细胞免疫荧光鉴定细胞纯度>95%。2.30 μg/mL医用臭氧提高IL-1β诱导的软骨细胞的细胞活力。采用CCK-8法检测医用臭氧对软骨细胞的细胞活性的影响,结果表明40-60μg/mL医用臭氧抑制IL-1β诱导的软骨细胞的细胞活性,抑制程度呈臭氧浓度的依赖性。与IL-1β组相比,30 μg/mL医用臭氧促进软骨细胞的活性(P<0.01),而50 μμg/mL和60 μg/mL组医用臭氧显著抑制软骨细胞活性(P<0.05)。为探究医用臭氧提高IL-1β诱导的软骨细胞细胞活力是否与自噬相关,将IL-1β诱导的软骨细胞加入自噬抑制剂3MA预处理,与Control组相比,IL-1β组、IL-1β+3MA+O3组和 IL-1β+3MA组均显著降低(P<C0.01),IL-1β+O3组与 Control组相比,差异无统计学意义;IL-1β+03组、IL-1β+3MA+03组和IL-1β+3MA组与IL-1β组相比,差异无统计学意义。为探究医用臭氧提高IL-1β诱导的软骨细胞细胞活力是否与激活AMPK相关,将IL-1β诱导的软骨细胞加入AMPK抑制剂com C预处理,与Control组相比,IL-1β组、IL-1β+com C+O3组和IL-1β+com C组明显降低;与IL-1β组相比,IL-1β+03组细胞活力显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01);IL-1 β+com C+O3组和IL-1β+com C组细胞活力与IL-11β组相比,差异无统计学意义。3.30 μg/mL医用臭氧显著提高IL-1β诱导的软骨细胞的自噬。Western blotting结果显示,与Control组相比,LC3II在IL-1β组、IL-1β+3MA+03组和IL-1 β+3MA组显著降低(P<0.01),IL-1 β+03组也降低(P<0.05)。与 IL-1β 组相比,IL-1β+O3组 LC3II 表达增加(p<0.05)。IL-1ββ+03组p62表达显著降低(p<0.01),3MA预处理组抑制了医用臭氧提高LC3II和降低p62表达。细胞免疫荧光结果显示,30 μμg/mL医用臭氧提高IL-1β诱导的软骨细胞内LC3II表达,抑制p62的表达,促进了软骨细胞的自噬。3MA预处理抑制了医用臭氧提高IL-1 β诱导的软骨细胞自噬的作用。4.30 μg/mL医用臭氧介导AMPK/mTOR信号通路提高IL-1β诱导的软骨的自噬。Western blotting结果显示,与Control组相比,IL-1β组p-AMPK蛋白表达下降,p-mTOR表达显著升高(P<0.01)。IL-1β+03组较IL-1β组p-AMPK蛋白水平显著升高,p-mTOR水平显著降低(P<0.01)。Beclin-1在医用臭氧的干预下表达显著升高(P<0.01),3MA抑制了医用臭氧对Beclin-1的上调。5.30 μg/mL医用臭氧抑制IL-1β诱导的软骨细胞IL-6和TNF-α mRNA表达qRT-PCR技术检测软骨细胞IL-6和TNF-α mRNA表达,结果显示IL-1 β+O3组软骨细胞中IL-6 mRNA表达水平与IL-1β组相比降低(P<0.05),IL-1 β+3MA组较Control组和IL-1β组仍维持较高水平。IL-1β+O3组TNF-α mRNA表达水平较IL-1β组显著降低(P<0.01),而3MA预处理TNF-α mRNA表达水平较IL-1β组有升高,但差异无统计学意义。6.compound C抑制医用臭氧上调IL-1β诱导的软骨细胞的自噬,抑制细胞凋亡。Western blotting和细胞免疫荧光结果显示,IL-1β+com C+O3组与Control组相比,LC3II水平下降,p62表达增加。相反,IL-1β+03组与IL-1β组相比,LC3I1水平显著升高,p62表达下降。IL-1β3组p-AMPK表达水平与Control组相比显著降低(P<0.00),com C预处理的p-AMPK也处于低水平。与IL-1β组相比,IL-1β+03 组和 IL-1β+com C+03 组 p-AMPK 水平显著升高(P<0.01),但IL-1β+com C+O3组较IL-1 β+03组p-AMPK水平降低,说明com C部分抑制医用臭氧上调p-AMPK水平。在IL-1β组和IL-1β+com C+03组的p-mTOR水平显著高于Control组(P<0.01),IL-1β+O3组p-mTOR水平显著低于IL-1β组(P<0.01)。ULK-1在IL-1β+O3组中表达高于IL-1β组(P<0.05)。IL-1β+O3组与IL-1β组比,Bcl2/Bax显著升高(P<0.01)。7.compound C抑制医用臭氧下调IL-1β诱导的软骨细胞IL-6和TNF-αα mRNA表达。qRT-PCR技术检测软骨细胞IL-6和TNF-α mRNA表达,结果显示与Control组相比,IL-1β组IL-6和TNF-α mRNA表达上调,与IL-1β组相比,IL-11β+03组IL-6和TNF-α mRNA表达均显著下调(P<0.01)。IL-1β+com C组的IL-6和TNF-α mRNA较IL-1β组表达增加。IL-1β+com C+O3组IL-6 mRNA表达较 IL-1β组相比增加,但TNF-α mRNA较IL-1β组相比表达显著降低(P<0.01)。8.compound C抑制医用臭氧下调IL-1β诱导软骨细胞的MMP-13 mRNA表达,促进TIMP-1 mRNA的表达。qRT-PCR检测结果显示,与IL-1β组相比,IL-1β+03组中MMP-13 mRNA表达显著降低(P<0.01),TIMP-1 mRNA表达显著升高(P<0.01);IL-11β+com C+O3组MMP-13 mRNA表达显著降低(P<0.01),TIMP-1 mRNA表达升高(P<0.05),说明com C抑制医用臭氧对软骨细胞的MMP-13和TIMP-1 mRNA的调节。9.30 μg/mL医用臭氧促进IL-1β诱导的软骨细胞内自噬小体的形成。透射电镜下观察结果显示,与Control组相比,IL-1β组软骨细胞内自噬小体的数量减少,IL-1β+03组软骨细胞内自噬小体的数量明显增加,而IL-β+3 MA+03组和IL-β+comC+O3组自噬小体的数量与IL-1β组无明显差异。结论医用臭氧通过激活AMPK/mTOR信号通路提高IL-1β诱导的软骨细胞自噬。此外,医用臭氧抑制IL-1β诱导的软骨细胞的炎症因子的转录,抑制软骨细胞外基质的分解并促进合成,为医用臭氧有效治疗OA提供了实验依据。