在泌尿系统受糖尿病影响而发生的一系列病理生理学改变中,十分常见且重要的一项即为糖尿病膀胱(diabetes cystopathy,DCP)。已有研究证实其发病过程伴随细胞凋亡水平的显著升高。内质网是细胞内负责在蛋白合成后通过折叠修饰使之进一步成熟的重要细胞器,对维持细胞正常稳态具有重要作用。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关性凋亡是机体除线粒体凋亡途径外又一条重要的内源性激活途径,包括细菌病毒感染、氧自由基堆积、离子泵功能障碍等多种体内外因素均可使之激活。在应激状态下,ERS因应激强度及持续时间的不同而触发不同的级联反应(Cascade):应激初期可代偿性缓冲环境压力,修复细胞;若应激持续存在,则诱导细胞凋亡。未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是机体对抗应激损害的重要机制,具体机制为:阻抑内质网分子伴侣及折叠酶的转录激活,并暂停早期蛋白质合成。同时对已堆积在内质网内的未折叠或错误折叠蛋白质进行空间结构及功能的修复,最终使受损细胞得以存续。如果细胞损伤程度过重,UPR则转入失代偿阶段,ERS相关性凋亡途径占据优势,最终诱导受损细胞凋亡。GRP78是UPR特征性标志物,而CHOP及Caspase12则被认为是ERS相关性凋亡标志因子。三者结合可以特异性地表征反映细胞ERS相关性凋亡所处阶段及强度,已被广泛应用于该领域的研究。糖尿病患者体内存在诸如高血糖、氧化应激、RAS系统激活、脂质代谢障碍等多种可诱发ERS的因素。ERS可显著促进多种糖尿病并发症(如糖尿病心肌病、糖尿病血管病变、糖尿病胃肠病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病肝病、糖尿病肾病等)发生进展的现象已在近年来国内外的诸多实验研究中被证实,但其对DCP病理生理学,特别是DCP逼尿肌病变发生进展的影响目前仍不清楚,开展相关领域的研究对于更加充分深刻地认识理解DCP的致病形成机理十分有意义。鉴于ERS相关性凋亡作为细胞内源性凋亡途径中重要组成部分以及诸多糖尿病其它并发症均被证实涉及ERS相关性凋亡的事实,我们推测:ERS相关性凋亡与DCP及其逼尿肌病变的发生进展亦应在病因学及病理生理学演变等方面具有相关性。为验证以上假说,我们通过第一部分动物在体实验进行了ERS相关性凋亡在链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型逼尿肌病变进展中的作用研究。主要内容为:1.以链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)腹腔注射法构建并鉴定糖尿病大鼠模型,在造模后不同时间点(STZ注射后4w、8w、12w和16w)依次测定各组大鼠尿动力学指标及逼尿肌收缩力;2.运用HE染色法及透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)分别观察评估糖尿病模型大鼠逼尿肌随病程进展在光镜下显微结构及电镜下超微结构的组织形态学演变,运用VG(Van Gieson)染色法检测并计算比较各组糖尿病大鼠不同病程阶段逼尿肌胶原纤维所占面积比例;3.运用SABC免疫组化染色法检测PCNA表达测定评估四个病程时点糖尿病模型大鼠逼尿肌细胞增殖水平,运用TUNEL染色法测定评估四个病程时点糖尿病模型大鼠逼尿肌细胞凋亡水平;4.以q RT-PCR及Western blotting法分别测定各组大鼠逼尿肌细胞三种ERS相关性凋亡标志因子GRP78、CHOP及Caspase12在m RNA及蛋白水平的表达变化,并分析GRP78表达与PCNA阳性表达率演变之间的相关性以及CHOP和Caspase12表达与凋亡指数演变之间的相关性。大量研究表明,在糖尿病其它并发症中,高葡萄糖血症(Hyperglycemia)作为独立危险因素可通过线粒体途径直接诱导并加重细胞凋亡,但在DCP研究领域,高葡萄糖血症是否能通过ERS途径影响逼尿肌细胞病理生理状态则鲜有报道。为了进一步检测高葡萄糖血症通过影响ERS相关性凋亡途径作用于DCP逼尿肌病变发生进展的情况,在第一部分实验证实ERS相关性凋亡与DCP发生发展密切相关的基础上,我们设计了第二部分体外细胞实验,以体外高葡萄糖浓度环境模拟在体的高葡萄糖血症,研究ERS对体外高糖环境下大鼠膀胱逼尿肌细胞(Detrusor smooth muscle cells,DSMCs)凋亡的影响效应。主要内容如下:1.分离、原代培养并通过α-SMA免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察鉴定大鼠DSMCs,之后将大鼠DSMCs分为正常葡萄糖浓度组(NG组)及高浓度葡萄糖浓度组(HG组);2.两组DSMCs在四个不同时点(12h、24h、48h和72h)在TEM下观察细胞超微结构的形态学演变;3.运用MTT比色法检测NG组及HG组在上述四个不同时点DSMCs增殖水平;运用Annexin V-FITC/PI双染,通过流式细胞术检测评估两组DSMCs在相应时点的凋亡水平;4.测定四个不同时点各组大鼠DSMCs上述三种ERS相关性凋亡标志因子在m RNA及蛋白水平的表达变化,并分析CHOP及Caspase12的表达与流式细胞术测得凋亡率之间的相关性。第一部分内质网应激相关性凋亡在链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型逼尿肌病变进展中的作用机制研究第一节糖尿病模型大鼠随病程进展逼尿肌功能学演变观察评估目的:观察评估糖尿病模型大鼠随病程进展的一般状况改变及其膀胱组织在尿动力学指标及逼尿肌收缩力方面发生的功能学演变情况。方法:取成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠50只,随机分为对照组(Control组)、糖尿病4周组(DM4w组)、糖尿病8周组(DM8w组)、糖尿病12周组(DM12w组)及糖尿病16周组(DM16w组),每组10只,共计5组。DM4w-DM16w四组大鼠同期采用一次注射法经腹腔注射60mg/kg的STZ溶液构建糖尿病大鼠模型,Control组同期给予腹腔注射等量不含STZ的缓冲液。糖尿病成模判定标准如下:注射后72h以刀片切割鼠尾末端行鼠尾静脉取血,血糖仪三次测得血糖浓度若大于300 mg/d L则判定该鼠已制备为糖尿病模型大鼠。在鉴定成模后分别于4w、8w、12w及16w分别对五组大鼠运用压力换能器及生物信号采集处理系统行包括膀胱最大容量、逼尿肌漏尿点压(Detrusor Leak Point Pressure,DLPP)和顺应性等指标在内的尿动力学检测;并在不同病程时点对接受尿动力学检测后的相应组别大鼠即刻处死,Control组大鼠与DM4w组大鼠同期处死,取出膀胱并制备逼尿肌肌条,运用生物信号记录分析系统行逼尿肌收缩力测定。结果:成功构建并鉴定获得四个不同病程时点的糖尿病大鼠模型。各模型组大鼠随病情进展逐渐呈现出三多一少(多饮、多食、多尿,瘦弱减重)、萎靡迟缓、倦怠少动、对痛感反应钝化。此外,还可见毛色转为灰黄,眼球由红转白,呈现白内障样浑浊,肢体可见大小不一的多发溃疡脓性创面等表现。四组糖尿病模型大鼠平均血糖水平、膀胱湿重及膀胱湿重/体重比值较对照组均显著升高;各组糖尿病模型大鼠平均体重均显著低于对照组大鼠,且随病程进展呈现逐渐降低趋势;各糖尿病模型大鼠组膀胱最大容量、顺应性及DLPP均显著高于对照组大鼠,且随病程进展逐渐升高;四组糖尿病模型大鼠逼尿肌平均收缩力均高于对照组大鼠,升高趋势随病程进展在DM8w组达到峰值,DM12w组及DM16w组较DM8w组有所回落。结论:(1)糖尿病对膀胱逼尿肌的顺应性、兴奋性、自律性均会造成损害,其收缩舒张功能障碍将引起一系列临床症状。(2)糖尿病模型大鼠膀胱功能障碍的进展呈现时间依赖性。(3)糖尿病模型大鼠膀胱功能障碍的演变存在代偿期向非代偿期的过渡,过渡时段可能为成模后8-12w。第二节糖尿病模型大鼠随病程进展膀胱逼尿肌组织形态学演变观察评估目的:观察评估糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌随病程进展在显微、超微结构水平以及胶原纤维含量方面发生的组织形态学演变情况。方法:取DM4W、DM8W、DM12W及DM16W四组大鼠及Control组大鼠膀胱逼尿肌组织,完成以下三项检测观察:行HE染色后于光镜下观察各组大鼠逼尿肌组织显微结构变化;行VG染色后于光镜下观察各组大鼠逼尿肌间质中胶原纤维并计算其面积所占百分比;接受组织特殊固定处理后在透射电镜下观察逼尿肌细胞包括内质网、细胞核等在内的超微结构的形态学变化。结果:HE染色光镜下观察膀胱逼尿肌肌束随病程进展走行渐紊乱,局部出现排列松散及肌纤维间隙增大现象,肌束间疏松纤维结缔组织渐增多且分布混乱;VG染色光镜观察见胶原纤维存在于逼尿肌间质中,随着糖尿病病程的进展,胶原纤维所占面积比例逐渐增多。除DM4w组大鼠,其余实验组大鼠膀胱逼尿肌胶原纤维所占面积比例差异与对照组大鼠相比均显著升高;透射电镜下见逼尿肌细胞随病程进展逐渐出现核旁内质网区域的脱颗粒及空泡化改变,并伴随内质网正常结构的破坏;细胞核外形渐扭曲。到糖尿病病程12w之后,散在空泡化改变出现广泛的融合现象,大量细胞核出现固缩及崩解现象,核仁渐消失并可见大量异常电子致密物沉积。结论:(1)随着糖尿病病程的进展,糖尿病模型大鼠出现不同程度的膀胱重构现象,逼尿肌组织形态及超微结构出现进行性破坏。(2)糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌间质胶原纤维随糖尿病病程的延长逐渐堆积增多,间质纤维化程度逐渐升高,与膀胱顺应性的下降密切相关。(3)糖尿病成模后8w-12w是膀胱逼尿肌组织形态加速破坏恶化的关键时段,与逼尿肌功能在此期间经历由代偿向失代偿的转变相对应。第三节糖尿病模型大鼠随病程进展膀胱逼尿肌细胞增殖与凋亡水平演变的研究目的:测定糖尿病模型大鼠随病程进展膀胱逼尿肌细胞增殖及凋亡水平的演变情况。方法:取不同病程时点糖尿病模型大鼠及对照组大鼠膀胱逼尿肌组织切片,运用SABC免疫组化染色法检测PCNA表达测定评估四个病程时点糖尿病模型大鼠逼尿肌细胞增殖水平,行TUNEL染色计算并比较各组大鼠膀胱逼尿肌凋亡阳性细胞百分比。结果:随着糖尿病病程的进展,糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌细胞PCNA平均阳性表达率与对照组大鼠相比均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),阳性表达率均值在造模后8w检测时点达峰,后逐渐回落,至造模后16w检测时点时,阳性表达率均值已与造模后4w检测值相近持平,但仍高于control组水平;随着糖尿病病程的进展,各实验组大鼠平均凋亡指数与对照组大鼠相比均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),凋亡指数平均数值呈现逐渐增长趋势,提示细胞凋亡水平逐渐升高。结论:(1)糖尿病模型大鼠DSMCs细胞数量变化呈现时间依赖性。(2)糖尿病模型大鼠DSMCs细胞凋亡水平较正常大鼠显著升高,并随糖尿病病程的延长呈现逐渐升高的趋势;细胞增殖水平亦显著高于正常大鼠,但存在渐次升高到逐渐回落的过渡。(3)成模后8w-12w对于糖尿病模型大鼠DSMCs的数量演变来说是一个重要的转折时段,是由增殖凋亡双上升,但以增殖为强的代偿阶段逐渐过渡为增殖回落凋亡继续走强占据主导的失代偿阶段。第四节糖尿病模型大鼠随病程进展膀胱逼尿肌细胞ERS相关性凋亡标志物表达变化的研究目的:在测定糖尿病模型大鼠随病程进展膀胱逼尿肌细胞增殖及凋亡水平演变情况基础上,通过对三种ERS相关性凋亡标志因子在m RNA及蛋白水平表达变化的检测,初步评估ERS相关性凋亡在糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌病程进展过程中的作用。方法:取不同病程时点糖尿病模型大鼠及对照组大鼠膀胱逼尿肌组织,以q RT-PCR及Western blotting法分别测定各组大鼠逼尿肌细胞三种ERS相关性凋亡标志因子GRP78、Caspase12及CHOP在m RNA及蛋白水平的表达变化,并分析上述三者表达与DSMCs增殖及凋亡水平演变的相关性。结果:各组糖尿病模型大鼠三种ERS相关性凋亡标志因子GRP78、Caspase12及CHOP的m RNA及蛋白表达水平均显著高于对照组大鼠,其中Caspase12及CHOP的m RNA及蛋白表达水平随病程进展均呈现逐渐升高趋势,而GRP78的m RNA表达水平于DM12w组达到峰值,其蛋白表达水平于DM8w组达到峰值。GRP78蛋白及m RNA表达与逼尿肌细胞PCNA阳性表达率均呈显著正相关,而CHOP及Caspase12蛋白及m RNA表达与逼尿肌细胞AI均呈显著正相关。结论:(1)UPR主导的细胞修复活动与ERS相关性凋亡在DCP病程进展过程中同时存在。(2)UPR主导的细胞修复活动在成模后8w-12w时段经历了由代偿性增强向失代偿性减弱的转变。(3)ERS相关性凋亡在DCP逼尿肌病变进展过程中是一个持续发挥负性效应且随时间延长强度不断增强的重要病理生理学事件。(4)糖尿病模型大鼠膀胱逼尿肌病变的发生发展与ERS相关性凋亡密切相关。第二部分:内质网应激对体外高糖环境下大鼠膀胱逼尿肌细胞凋亡的影响研究第一节大鼠逼尿肌细胞的分离、纯化、培养、传代及鉴定目的:通过适宜的体外分离、原代培养、传代以及准确明晰的鉴定,为后续实验获取活性良好的可靠DSMCs。方法:运用胶原酶Ⅱ(4mg/m L)分离并原代培养DSMCs,之后通过α-SMA免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察鉴定大鼠逼尿肌细胞。结果:原代培养的大鼠DSMCs在光镜下呈长梭形。分离后经培养8 h左右即可见细胞出现伸展贴壁现象,提示细胞活性良好。ɑ-SMA免疫荧光染色后在激光共聚焦显微镜下可见DSMCs的梭形胞质呈现特异性的绿色荧光,提示胞质内特异性地表达平滑肌标志蛋白ɑ-SMA;胞核则呈现DAPI特异性的蓝色荧光。结合细胞形态观察及免疫荧光染色阳性结果,可综合判定所分离培养之细胞为DSMCs。结论:(1)采用适宜浓度及合理消化时间的胶原酶Ⅱ消化法可以高效快捷地分离出活性良好、生理性能稳定的DSMCs。(2)运用上述方法在24-48 h内分离得到的原代培养的DSMCs能够满足后续实验研究的要求。第二节体外高糖环境下大鼠膀胱逼尿肌细胞超微结构观察评估目的:在体外构建单纯的高糖环境,模拟在体的高葡萄糖血症,观察DSMCs在接受体外不同时长高浓度葡萄糖刺激下的情况下,细胞超微结构形态学的改变。方法:将细胞同步化处理后的DSMCs分为接种于高浓度葡萄糖(25m M)液体培养基组(HG组)及接种于正常浓度葡萄糖(5m M)液体培养基对照组(NG组)。接受特殊固定处理后在透射电镜下观察两组DSMCs在接种后12 h、24h、48 h和72 h四个不同时点的超微结构形态学变化。结果:镜下见NG对照组DSMCs细胞核形态结构正常,染色质向核膜聚集分布;胞浆内可见核周区域层叠分布的内质网及其间散在分布的线粒体,形态结构未见明显异常,在不同培养时间点的NG组细胞超微结构亦未见明显差异。与对应NG组DSMCs相比,HG12h组及HG24h组DSMCs的镜下表现并未见明显的差异,部分细胞的核周区域可见空泡结构的出现,但并非普遍现象。当高糖刺激时长延至48 h时,在HG48h组DSMCs内的核周区域开始出现较多量的囊泡结构,内质网逐渐变得肿胀,并伴有轻度脱颗粒现象。部分细胞的核膜形态变得不规则,部分区域弯卷折叠,出现质膜微囊。在持续接受高糖刺激72 h之后,HG72h组的部分DSMCs细胞核出现扭曲固缩,体积变小,形态渐失常,并可见多量的黑褐色电子致密物沉积于核膜内侧区域,而核周的内质网及线粒体分布区域则未见明显的形态结构进一步恶化的表现。此外,在各组细胞镜下观察时均可见到DSMCs典型的凋亡影像以及特征性的凋亡小体,NG组及HG12h组数量较少,高糖刺激24 h后的各组细胞中则有所增多。结论:(1)体外高糖环境下DSMCs在接受不同时长(0-72 h)刺激时,其细胞超微结构演变时间依赖性并不显著。(2)各组细胞中均可观察到典型凋亡小体结构,NG组及HG12h组数量较少,高糖刺激24 h后的各组细胞中则有所增多。第三节体外高糖环境下大鼠膀胱逼尿肌细胞增殖及凋亡水平的演变目的:检测并定量评估体外高糖浓度环境不同时长刺激对DSMCs增殖及凋亡水平的影响。方法:运用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定NG组及HG组对数生长期DSMCs在12h、24h、48 h和72 h四个不同时点的吸光值(OD值);运用Annexin V-FITC/PI双染法对细胞染色,并以流式细胞术测定两组DSMCs在上述四个时点的早期、晚期凋亡率以及总凋亡率。结果:除12 h时点两组的平均OD值无明显统计学差异外,HG组在24h、48 h和72 h的平均OD值均显著低于NG组(P<0.05);NG组DSMCs平均OD值逐渐增高,HG组DSMCs平均OD值则随接受刺激时间的延长逐渐降低。与NG组DSMCs相比,除HG12h组早期、晚期及平均总凋亡率与之基本持平,数据未见统计学差异外,HG24h组、HG48h组、HG72h组DSMCs的早期、晚期及平均总凋亡率均显著升高(P<0.05);各高糖刺激组DSMCs的早期、晚期及总凋亡率均值数据随接受刺激时间的延长逐渐升高。结论:(1)体外高糖环境刺激对于大鼠DSMCs存在显著的抑制增殖及诱导凋亡的负性效应,且该效应随接受体外高糖环境刺激时间的延长而逐渐加重。(2)体外高糖刺激后12-24 h是DSMCs凋亡水平跃升的关键时段。第四节体外高糖环境对大鼠逼尿肌细胞ERS相关性凋亡标志物的表达影响目的:初步评估ERS在体外高糖环境刺激DSMCs凋亡进展过程中的作用,并以此验证“高葡萄糖血症可直接诱发并加重DCP逼尿肌病变发生进展过程中ERS相关性凋亡”的观点。方法:取四个检测时点NG组及HG组DSMCs,以q RT-PCR及Western blotting法分别测定三种ERS相关性凋亡标志因子GRP78、Caspase12及CHOP在m RNA及蛋白水平的表达变化,并分析Caspase12及CHOP表达与DSMCs流式细胞术测得凋亡率演变的相关性。结果:HG组DSMCs四个检测时点的三种ERS相关性凋亡标志因子的m RNA及蛋白表达水平均显著高于NG组,差异具有统计学意义(P<0.05)。其中Caspase12及CHOP的m RNA及蛋白表达水平随体外高糖环境刺激时间的延长均呈现逐渐升高趋势,而GRP78的m RNA及蛋白表达水平于HG组24 h时达到峰值后渐回落。CHOP和Caspase12的蛋白及m RNA表达与DSMCs流式细胞术测得凋亡率均呈显著正相关。结论:(1)体外高糖环境刺激诱导DSMCs凋亡的过程是一个由于ERS持续不减弱导致UPR由代偿走向失代偿,而ERS相关性凋亡强度不断加重的病理生理学过程。(2)UPR在体外高糖环境刺激24 h后出现了代偿性增强向失代偿性减弱的转变。(3)高葡萄糖血症能够通过ERS相关性凋亡途径影响DCP逼尿肌病变的发生进展。