在前期工作和大量查阅文献的基础上,我们通过分子拼合原理设计并合成了一系列磺酰胺衍生物,并对所合成的系列化合物进行了构效关系研究,探讨了肿瘤抑制活性最强的含苯并咪唑基团的磺酰胺衍生物3328的生物机制。详细研究内容如下:1、我们通过分子拼合原理设计合成了 31个磺酰胺类衍生物:10a-10e,13a-13g,14a-14f,17a-17f,18a-18g;并讨论了取代基团、磺胺基团、苯并咪唑基团对抗肿瘤活性的影响。结果表明,A环苯基取代基在一定程度上影响化合物的抗增殖活性,苯并咪唑和苯并噻吩基团可增强化合物的抗肿瘤活性和选择性。B环的3,4,5-三甲氧基对抗增殖活性具有重要作用,其他基团取代时化合物的活性减弱或丧失。化合物的体外抗肿瘤活性随C环的取代基变化而受到影响,其中4-甲基取代时活性最好。2、MTT法检测新型磺酰胺系列衍生物对人胃癌细胞(MGC-803)、人前列腺癌细胞(PC-3)和人乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制活性。结果表明,部分化合物对三种肿瘤细胞显示出较好的抑制活性,其中化合物3328的活性最好,对三种肿瘤细胞的IC50值分别为 1.02μmol/L(MGC-803)、3.34μmol/L(PC-3)、5.40μmol/L(MCF-7)。基于体外抗肿瘤活性筛选结果,选择化合物3328和人胃癌细胞MGC-803进行深入的抗肿瘤机制研究。3、通过克隆形成实验和生长曲线实验判断化合物3328作用后细胞活力大小。实验结果表明化合物3328能够以时间依赖的方式显著抑制人胃癌细胞MGC-803的生长,并阻碍集落形成。因此,我们通过流式细胞术检测细胞周期的变化。结果显示化合物3328能将细胞周期阻滞在G2/M期。Western Blotting实验检测G2期相关蛋白CyclinB1、CDK1和M期相关蛋白p-Histone3(M期阻滞的分子marker)的表达变化,进一步证实了此结论。4、探讨化合物3328抑制细胞增殖的机制。由于MAPK/ERK信号通路与细胞增殖有关,我们通过Western Blotting检测了化合物3328作用后MAPK/ERK信号通路相关的蛋白Ras、c-Raf、p-c-Raf、p-MEK、ERK、p-ERK的表达。结果表明,化合物3328抑制了 Ras-Raf-MEK-ERK这条信号通路上的蛋白,并且其下游的转录因子FoxO3a和c-Myc也被抑制。文献报道,AKT/mTOR信号通路与MAPK/ERK信号通路在胃癌的进展中有协同作用,因此我们又检测了AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-AKT,p-mTOR。这两个蛋白的表达也呈现出浓度依赖性下调。这两条通路与肿瘤细胞的增殖相关,当被抑制时,可抑制肿瘤细胞增殖。因此,我们认为化合物3328可能通过作用于MAPK/ERK和AKT/mTOR通路而抑制人胃癌细胞MGC-803的增殖。5、由于外界刺激而使细胞发生凋亡是肿瘤细胞死亡的方式之一。因此,我们通过FITC-AnnexinV/PI双染方法检测化合物3328是否能诱导人胃癌细胞MGC-803发生凋亡。并通过DAPI荧光染色实验来观察细胞的形态变化。结果显示,化合物3328作用于人胃癌细胞MGC-803 48 h后,凋亡率呈浓度依赖性显著增加,细胞核染色加深,核质出现固缩和破裂,抗凋亡蛋白Bcl-2和MCL-1都被下调,促凋亡蛋白Noxa被上调,Cleaved-Caspase-7蛋白被激活,它的底物蛋白PARP也被明显切割。另外重要的内源性细胞凋亡抑制因子c-IAP1和XIAP表达下调。这些结果表明化合物3328能诱导人胃癌细胞MGC-803发生凋亡。6、为了进一步验证化合物3328在人胃癌细胞中作用机制的可靠性,我们选取了另外两株人胃癌细胞SGC-7901和HGC-27进行上述的研究。结果显示,化合物3328对人胃癌细胞SGC-7901和HGC-27的抑制作用也较强,其IC50值分别为2.3 μmol/L和1.61 μmol/L,且能够明显抑制两株胃癌细胞的活力并阻碍克隆形成。化合物3328作用后细胞周期被阻滞在G2/M期,MAPK/ERK和AKT/mTOR两条通路的蛋白均呈现浓度依赖性下调。这两株胃癌细胞的凋亡率随浓度增大而增大,凋亡相关蛋白与人胃癌细胞MGC-803中的变化一致。另外,化合物3328对正常人胃上皮细胞GES-1的毒性较小(IC50值为15.22 μmol/L)。这进一步验证了我们实验结果的可靠性。以上结果表明,我们通过分子拼合原理合成的磺酰胺衍生物3328对人胃癌细胞具有较好的抑制活性。化合物3328能够通过抑制MAPK/ERK通路和AKT/mTOR通路抑制人胃癌细胞的增殖,将细胞周期阻滞在G2/M期,诱导人胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和HGC-27发生凋亡,并且对正常人胃上皮细胞GES-1无明显毒性。这些发现为该类型抗胃癌药物的研发提供了研究基础。