【摘 要】
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核酸适体以其高亲和力、高特异性等优势被广泛应用于生物检测分析等领域。本论文的研究基于核酸的特异性识别、构象变换的特性,结合信号调控以及信号放大方法,主要开展以下工作:1、小分子响应的变构适体改造sgRNA调控CRISPR/Cas9体系。该工作开发了一种利用小分子响应激活的变构适体调控的SMART-sgRNA来控制CRISPR/Cas9系统的通用方法。结合核酸序列互补热力学平衡以及核酸适体识别小分子
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核酸适体以其高亲和力、高特异性等优势被广泛应用于生物检测分析等领域。本论文的研究基于核酸的特异性识别、构象变换的特性,结合信号调控以及信号放大方法,主要开展以下工作:1、小分子响应的变构适体改造sgRNA调控CRISPR/Cas9体系。该工作开发了一种利用小分子响应激活的变构适体调控的SMART-sgRNA来控制CRISPR/Cas9系统的通用方法。结合核酸序列互补热力学平衡以及核酸适体识别小分子发生构象变化的特点,获得了靶标EGFP对应的变构适体改造的sgRNA。通过改变靶标序列,获得了 Luciferase、TurboRFP等靶标的改造sgRNA序列。对改造的sgRNA进行CRISPR/Cas9体系体外调控能力、分子对接以及细胞内调控能力等的考察。该种设计具有设计简单、活性保留高、通用性高等优点,有望应用于高效率的多重基因的同时调控。2、基于CRISPR/Cas9技术与液滴数字PCR联用检测循环肿瘤DNA突变。该工作发展了一种基于CRISPR/Cas9技术与液滴数字PCR联用的循环肿瘤DNA突变检测平台。通过PAM序列的设计,构建CRISPR/Cas9体系精确识别野生型与突变型基因,降低背景野生型的干扰,提高突变型的检出率。对CRISPR/Cas9体系识别KRAS野生型与突变型基因的效率、基因混合切割情况等进行了考察。结合液滴数字PCR技术,本文发展了低比例突变型基因的高灵敏检测方法,有望应用在肿瘤早期诊断、肿瘤治疗以及预后监测等领域。3、变构分子信标与CRISPR/Cas12a体系联用高灵敏检测靶标。该工作发展了变构分子信标与CRISPR/Cas12a体系联用方法用于核酸,蛋白质等靶标的高灵敏检测。利用核酸适体识别靶标的高亲和力,以及识别靶标发生构象变化的特点,联用CRISPR/Cas12a体系信号放大的高灵敏度,构建了高效靶标检测平台。对变构分子信标序列设计、CRISPR/Cas12a信号放大体系进行了考察,实现了H1N1以及凝血酶的高灵敏检测。通过简单更换使用的适体类型,该方法可实现多种靶标的检测,有望应用于复杂样品中核酸、蛋白质以及小分子的高灵敏检测。4、基于双适体识别激活邻位连接技术与液滴数字PCR联用检测肿瘤来源外泌体PD-L1。该工作发展了双适体协同识别激活的邻位连接联合液滴数字PCR方法,构建了肿瘤来源的外泌体PD-L1检测平台。利用核酸适体识别靶标的高亲和力,协同识别的高特异性以及液滴数字PCR的高灵敏度,构建了高效肿瘤来源外泌体PD-L1蛋白的鉴别方法。对模型细胞的外泌体PD-L1进行了定量,并对临床样品进行了准确识别,确认肿瘤来源的外泌体PD-L1作为肿瘤诊断标记。通过简单替换或增加应用的适体类型,该方法可实现多种外泌体亚型或多路分析,有望促进外泌体转化为可靠的临床指标,以及深入探索来自不同细胞来源的外泌体的生物学功能。
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