蜘蛛丝被研究者们认为是最具有潜力的生物材料。由于蜘蛛同类之间相互残食,因而通过人工饲养的方法收集蛛丝是不可行的。目前主要通过基因工程的方法来获得蛛丝蛋白,然后通过静电纺或湿纺等仿生的手段来制备丝纤维。但是这两种纺丝过程所使用的有机物使得功能性蛋白失活,残留的有机溶剂不利于细胞的生长。目前新兴的微流体(microfludic device)设备模拟天然蜘蛛纺丝的过程,在生理环境下所形成的丝纤维没有有机物的残留,是理想的生物医学材料。因而通过微流体设备纺丝制备符合商业化需求的丝纤维将成为蛛丝仿生未来的发展方向。本论文以容易成丝的重组包裹丝(W2CT)为基本原料,以移液器枪头作为小型微流体设备来制备具有各种功能的杂合丝纤维并且对丝纤维的性能进行检测,为后续利用大型微流体设备制备商业化功能丝纤维提供方法支持。首先,我们将3种不同分子量和结构特征的外源蛋白质,用荧光染料标记后与重组包裹丝W2CT混纺。考马斯亮蓝染色和荧光扫描显示,不同分子量的蛋白质都能够均一稳定的存在于重组包裹丝纤维里面,这一结果被荧光显微镜下观察到的丝纤维的荧光现象进一步证实。此外,研究表明混合杂合丝的力学性能会有不同程度的下降,而神经生长因子与重组包裹丝所制备的丝纤维,其丝的力学性能也发生了下降,从而意味着神经生长因子也可以通过该方法进入到丝纤维里面。这一方法为利用微流体设备在自然条件下通过简单的混纺制备出携带功能蛋白的丝纤维提供基础的技术支持。其次,蛋白质内含子的反式剪接技术首次被应用于蛛丝的功能化修饰。在体外通过Ssp DnaB S0蛋白质的反式剪接作用,在蛋白质水平上将12KD泛素相关修饰蛋白(SUMO)与蛛丝蛋白(W2CT)连接形成功能化蛛丝蛋白SUMOW2CT。研究结果显示SUMOW2CT自动成丝速度和产量约为W2CT的一半,但是SUMOW2CT形成的丝纤维中sumo蛋白仍保持着正确三维结构,可被sumo蛋白酶酶切。实验结果表明了断裂蛋白质内含子介导的蛛丝功能化修饰平台的成功建立,并且微流体纺丝设备制备的丝纤维仍可以保持外源蛋白的生物活性,为蛛丝的功能化修饰和应用提供了新的技术和思路,为后续微流体设备制备功能性材料提供了新的方法。接着,我们首次通过蛋白质内含子的反式剪接技术,将拖丝模块与包裹丝模块在体外进行拼接,获得产量没有明显降低的杂合丝蛋白w2c4ct和w2c8ct。来自w2c4ct和w2c8ct的丝纤维(fhf4和fhf8)与来自w2ct和w2ct/c8ct的丝纤维(w和mhf8)相比表面结构更加光滑,并且具有更强的力学性能和耐腐蚀性。杂合丝hfh4与w丝纤维相比具有更高的抗拉强度,但是含有8个c模块的杂合丝蛋白w2c8ct所制备的丝纤维(hfh8)的性能却相对降低。这说明为了获得性能改善的丝纤维,外源蛛丝蛋白重复模块的大小需要进一步被优化。我们的结果显示蛋白质内含子介导的蛛丝蛋白之间重组的改性方法是一种新的获得大分子杂合丝蛛丝蛋白和有效改变丝纤维性能的便捷方法。最后,在蛛丝改性过程中,蛋白质内含子的引入使得实验过程更简便,但是由于蛋白质内含子对于外显子具有选择性,为了提高蛋白质内含子在蛛丝改性中的通用性,我们将dna体外展示技术用于构建蛋白质内含子的体外定向进化系统。为了验证该系统的可行性,实验构建了两个基因,即含有具有剪接活性的蛋白质内含子c端的阳性基因irc和含有不具有剪接活性的蛋白质内含子c端的阴性基因ircm。实验过程制备了人为的基因“突变库”,即将irc:ircm以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮的筛选后,阳性基因irc可以被10倍的富集,证明了体外筛选平台的建立成功,为后续针对不同宿主外显子进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选平台,也为断裂蛋白质内含子在蛛丝改性领域开拓更为广泛的应用前景奠定基础。本文针对蛛丝仿生存在的两个主要问题,1.电纺和湿纺过程中有机溶剂使得功能性蛋白失活,并且残留的有机溶剂影响细胞的生长;2.微流体设备纺丝技术缺少实验数据进行了系统性的研究。首先我们以到目前为止生理环境下最容易成丝的重组包裹丝为原料,以实验室的移液器枪头为小型微流体设备,通过简单的混合或者蛋白质内含子介导的融合制备功能化的丝纤维,并且建立了功能化过程中应用到的蛋白质内含子的体外定向进化系统,以期为蛛丝的功能化提供通用性断裂蛋白质内含子。本实验研究为后续以重组包裹丝为原料,并通过微流体纺丝设备制备商业化的功能化丝纤维奠定坚实的方法技术支持。