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自1873年Metchnkov首次使用金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)成功防治奥地利金龟(Anisoplia austriaca)后,绿僵菌作为真菌杀虫剂被广泛研究。随后在1883年Sorokin以金龟子绿僵菌为模式种建立绿僵菌属Metarhizium,绿僵菌的研究步入以形态特征为主要分类依据的时期。随着分子技术和基因工程的发展,分子数据便被广泛用于系统发育研究。尤其是PCR技术的出现及DNA测序技术的不断完善,使得系统发育分析成为可能。近年来系统发育分析的方法日益完善,多基因系统发育关系分析也被广泛应用于反映物种的进化历史。本文主要研究了中国绿僵菌的分类情况。首先将采集的僵虫用僵虫分离法分离绿僵菌,即用细针从僵虫上挑取绿色孢子于SDAY培养基上划线培养筛选绿僵菌。对采集的土壤用多果定选择性培养基筛选绿僵菌。待这两种培养基上的菌落产孢后,分别观察菌落形态,即菌丝和孢子的颜色,并在光学显微镜下观察孢子形态大小,待初步鉴定为绿僵菌后,将目标菌株转移至SDAY培养基上纯化。结合安徽农业大学微生物防治重点实验室菌种库(RCEF)中的绿僵菌种源,对其进行活化培养。通过分子学方法和形态学方法对得到的共134株绿僵菌菌株进行鉴定。根据Kepler&Rehner[1]的研究表明,Mz IGS3基因能够有效鉴定金龟子绿僵菌复合种。为了验证Mz IGS3基因对金龟子绿僵菌复合种的鉴定效果,实验通过Mz IGS3基因对134株绿僵菌进行初步鉴定,结合EF-1a基因对其他绿僵菌进行补充性初步鉴定,再通过三基因测序对Mz IGS3基因和EF-1a基因初步鉴定中的模糊种进一步鉴定。1、实验通过MzIGS3基因对134株绿僵菌进行初步鉴定。通过Mz IGS3基因扩增,最终得到100株菌株的序列。根据这100株菌株序列构建的单基因系统发育树,可将这100株绿僵菌划分为Clade I~Clade VIII共8个大分支。依据Mz IGS3系统发育树可知,分支A、B、C构成Clade I。分支C鉴定为平沙绿僵菌Metarhizium pingshaense,分支A、B中的菌株为模糊种。Clade II鉴定为洛泊斯绿僵菌Metarhizium robertsii。Clade III鉴定为金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae。Clade IV可能为棕色绿僵菌Metarhizium brunneum。Clade V由分支G、H、I组成,分支中的菌株均为模糊种,需进一步鉴定。Clade VI鉴定为大孢绿僵菌Metarhizium majus。Clade VII鉴定为鳞腮绿僵菌Metarhizium lepidiotae。Clade VIII鉴定为蚱蜢绿僵菌Metarhizium acridum。2、EF-1a基因初步鉴定中10株鉴定为金龟子绿僵菌复合种中的菌株,4株鉴定为柱孢绿僵菌Metarhizium cylindrospora,13株鉴定为瘿绵蚜绿僵菌Metarhizium pemphigi,4株为模糊菌株,1株为低温绿僵菌Metarhizium frigidum,1株为莱氏绿僵菌Metarhizium rileyi,1株未知菌株Ma123。3、多基因分析能准确的鉴定不同的种,利用多基因构建的系统发育树更接近真实的物种树,并准确的反映不同物种的分类地位。结合三基因发育分析,对于Mz IGS3基因系统发育树中模糊菌株进行进一步鉴定。Clade I中的Ma106和Ma141鉴定为金龟子绿僵菌,其他菌株均鉴定为平沙绿僵菌。Clade IV鉴定为棕色绿僵菌。Clade V中分支G中的Mf03鉴定为平沙绿僵菌,其他菌株鉴定为贵州绿僵菌Metarhizium guizhouense,分支H鉴定为大孢绿僵菌,分支I鉴定为柱孢绿僵菌。对于EF-1a基因系统发育树中的模糊菌株进一步鉴定,4株为模糊菌株鉴定为瘿绵蚜绿僵菌,未知菌株Ma123鉴定为一新种——安徽绿僵菌Metarhizium anhuiense。根据三基因分析并结合形态特征,可知本文的134株菌株共可分为13个种,即金龟子绿僵菌、棕色绿僵菌、平沙绿僵菌、洛泊斯绿僵菌、贵州绿僵菌、大孢绿僵菌、鳞腮绿僵菌、蚱蜢绿僵菌、柱孢绿僵菌、瘿绵蚜绿僵菌、低温绿僵菌、莱氏绿僵菌、安徽绿僵菌。这13个种包括3个中国新记录种和1个新种。3个中国新记录种分别是棕色绿僵菌、洛泊斯绿僵菌和低温绿僵菌。新种为安徽绿僵菌。4、菌株Ma123鉴定为一新种,即安徽绿僵菌Metarhizium anhuiense。Ma123在SDAY/4培养基上25℃培养,7天菌落直径约15-17mm,14天菌落直径达到33-52mm。菌落绒毛状,最初白色,产孢时从中心部位开始产孢,向外围扩散,开始为黄色,后逐渐成绿色。培养时有时会有紫色的代谢产物液滴产生。边缘规则平整。菌丝有隔、透明、光滑,直径1.2-2.6μm。分生孢子梗上多1-3个瓶梗,瓶梗柱形,6.4-18.3×2.0-3.5μm。分生孢子单细胞,柱状6.6-4.8×3.7-1.5μm,较短。孢子一般在瓶梗上向基性排列成分生孢子长链。