【摘 要】
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SREBPs（Sterol regulatory element binding proteins）是一类转录因子家族,通过控制一系列内源胆固醇的必需酶、脂肪酸、甘油三酯及磷脂的表达调控脂质平衡。SREBPs有三种亚型,即SREBP1-a、SREBP1-c和SREBP2。SREBP2主要调控胆固醇的合成代谢。SREBP是调控胆固醇和脂质代谢的重要转录因子,其前体是位于内质网的膜蛋白。成熟形式的SR
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SREBPs（Sterol regulatory element binding proteins）是一类转录因子家族,通过控制一系列内源胆固醇的必需酶、脂肪酸、甘油三酯及磷脂的表达调控脂质平衡。SREBPs有三种亚型,即SREBP1-a、SREBP1-c和SREBP2。SREBP2主要调控胆固醇的合成代谢。SREBP是调控胆固醇和脂质代谢的重要转录因子,其前体是位于内质网的膜蛋白。成熟形式的SREBP在高尔基体上切割产生,并运输到细胞核内发挥转录因子的作用。除了作为转录因子外,SREBP是否有其它细胞学功能尚不清楚。实验室的前期工作发现,用p Lvx-nSREBP2-IRES-Zs Green去感染细胞,始终得不到存活的细胞株,因此我们构建了Teton-Dox-nSREBP2-NIr D质粒,通过慢病毒包装的方法感染Hela-Cas9细胞,经过Doxycycline（Dox）诱导,检测细胞的nSREBP2、Cas9和EGFP的表达情况等挑选出Teton-nSREBP2-EGFP单克隆细胞株。我们在共聚焦显微镜下拍摄并捕捉到了细胞死亡的动态过程,根据细胞死亡的动态反应,我们猜想这个细胞死亡现象可能与细胞焦亡的关键基因GSDMD有关,于是我们在Teton-nSREBP2-EGFP单克隆细胞的基础上建立了GSDMD敲除细胞系,挑出单克隆后,我们也拍摄了GSDMD敲除细胞的死亡情况,但是通过对比,GSDMD敲除细胞并不会因为Dox诱导而死亡。接下来,我们推测Dox诱导的nSREBP2过表达引起了胆固醇合成通路基因的上调,从而导致甾醇的堆积造成细胞的脂毒性死亡。我们分别用TetonnSREBP2-EGFP的质粒感染实验室已有的胆固醇合成通路基因分别KO的细胞,结果表明细胞的死亡和胆固醇合成通路中的基因没有关系。为进一步探索nSREBP2过表达诱导细胞死亡的分子机制,我们在Dox诱导细胞死亡的条件下利用RNAseq技术找到了782个nSREBP2上调的候选基因,为了进一步缩小候选基因的范围,我们对Dox诱导细胞致死的条件做了最适浓度及时间优化的实验,并进行了大规模筛选实验,得到343个候选基因。结合RNAseq结果和筛选结果,最终得到44个候选基因。综上所述,我们首先通过构建Tet-on-Dox诱导nSREBP2表达系统确定了nSREBP2过表达时引起的细胞死亡方式十分特殊。其次证实了细胞焦亡关键基因GSDMD和胆固醇合成通路里的相关基因并不参与nSREBP2过量表达所引起的细胞死亡现象。最后通过CRISPR/Cas9大规模筛选和RNAseq分析,最终找到44个候选基因。我们的研究为进一步揭示nSREBP2影响细胞命运的机制奠定了基础。细胞死亡一直是细胞生物学关注的核心问题之一,和许多人类疾病息息相关。该工作一方面将丰富我们对细胞死亡的认识,另一方面也会对很多代谢疾病的诊治提供理论依据。
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