错合畸形是普遍存在于口腔中的伴有不同程度牙列不齐和(或)上下牙弓关系不调的状态;这种存在于口腔内的不调关系不仅影响日常生理功能,还会一定程度影响患者的面部美观,畸形严重者甚至干扰人们的心理健康和正常社会交往。因而,前来正畸治疗的患者特别是成人患者逐年增多,以求改善口腔生理功能和实现美观的要求。而在我国,成人患牙周病的患病率高达80%以上。牙周病是由口腔内的致病菌感染引起的一种慢性进行性性疾病,对牙周组织造成的不可逆性损害使其位居牙齿缺失的原因之首。因而治疗牙周病的首要任务是炎症的控制,同时近年来组织工程技术的突破性发展也为治疗提供了更多的思路。自2004年Seo发现牙周膜中存在着干细胞并且鉴定出其具有间充质干细胞特性后,牙周膜干细胞(human periodontal mesenchymal stem cells)作为一种重要的种子细胞很快应用于牙周缺损修复之中。然而h PDLSCs所处的微环境对于其干性的发挥有着不可忽略的作用,研究发现TNF-α,IL-1β等炎症因子会对h PDLSCs细胞有丝分裂,多向分化潜能造成一定损害。而处于炎症微环境中的h PDLSCs对正畸力的反应也不同,课题组前期研究也证实了这一结论,适宜于健康牙周组织的静态牵张力(static mechanical strain,SMS)会对牙周病来源h PDLSCs的干细胞性能产生明显的抑制作用,但其对PPDLSCs产生这种效应的可能机制仍未知。同时查阅文献还发现,机械应力和炎症微环境也会影响细胞内网络框架结构——细胞骨架(cytoskeleton)的代谢,进而影响细胞的增殖分化,收缩与迁徙,物质运输等功能。研究已证实Rho家族蛋白小分子扮演着真核细胞骨架重组分子开关的角色,是其最重要的信号通路。但Rho通路是否影响炎症来源的h PDLSCs间充质性能以及这种影响与机械应力作用下细胞骨架重组相关性的研究仍然未知。为了较深入研究静态牵张力诱导的炎症hPDLSCs细胞骨架重排及其对炎症h PDLSCs干细胞特性的调控的可能机制,这将会为具有牙周健康问题的患者仍然可以实现正畸治疗的目的提供临床依据。研究内容:本研究主要包括三个实验,实验一:HPDLSCs/PPDLSCs的培养,鉴定及SMS加载装置的初步构建。主要包括两种微环境来源h PDLSCs形态学观察,干细胞表明标记物观察,细胞增殖和分化能力检测及加载系统的初步构建。实验二:12%静态牵张力对HPDLSCs/PPDLSCs分化及细胞骨架重排的影响。实验三:Rho/ROCK通路对12%静态牵张力诱导的的HPDLSCs/PPDLSCs成骨分化及其与细胞骨架重组相关性的研究。研究方法:1)低密度稀释法传代培养HPDLSCs/PPDLSCs,流式细胞仪确定细胞间充质来源,克隆形成和MTT试验检测细胞再生活性,然后茜素红和油红O染色分别检测成骨和成脂分化潜力,按照FX-4000T系统说明书进行0.1Hz,12%,12h SMS加载,初步观察两种细胞。2)加力条件下,利用流式细胞仪检测细胞周期;ALP染色和ALP活性检测,茜素红染色检测HPDLSCs/PPDLSCs成骨分化;FITC-鬼笔环钛免疫荧光染色和共聚焦显微镜检测观察细胞骨架,Western Blot检测ALP,Runx2和细胞骨架调节蛋白Rho-A,ROCK1,p-cofilin,cofilin,Rho-GDIα的表达水平。3)利用Y27632特异性抑制Rho通路信号的传导,流式细胞仪检测12%SMS加载下HPDLSCs/PPDLSCs细胞周期;茜素红染色和Western Blot检测成骨分化变化;FITC-鬼笔环钛免疫荧光染色和CLSM观察细胞骨架重排,Western Blot检测骨架调控蛋白表达情况。实验结果1.分别从健康和炎症牙周膜组织中成功分离并培养成h PDLSCs,两种细胞均大致呈梭形,漩涡或放射状排列;二者均强表达间充质表面标记物CD29,CD90,CD146,而对于CD31和CD14呈现低表达状态;而PPDLSCs克隆形成率为73%远高于HPDLSCs的47%,而细胞活性均强于HPDLSCs,并且在第5天和第6天时活性明显增强;然而,经过成骨/成脂诱导培养的HPDLSCs矿化结节的形成数量较多,体积较大而且染色较深;PPDLSCs矿化结节染色分散,体积小,染色较浅。HPDLSCs形成更多的脂滴,面积较大且聚集分布;PPDLSCs脂滴面积小且稀疏分布。12%SMS加载后,HPDLSCs较加力前更为细长,呈栅栏状彼此平行排列趋势,且细胞长轴与牵张力加载方向垂直排列,细胞体边缘伪足减少,PPDLSCs细胞稍显不规则,部分细胞边缘有凹陷产生,细胞稍显圆润,不规则细胞比例增加。2.流式细胞仪结果显示,静置组,PPDLSCs细胞增殖指数(PI=G2+S)明显高于HPDLSCs;而12%SMS加载后,HPDLSCs较加力前PI指数明显增加,PPDLSCs较加力前和加力组HPDLSCs的PI值明显下降。分化能力检测结果显示,静置组,PPDLSCs的ALP染色,茜素红染色,ALP活性,油红O染色均弱于HPDLSCs,且前者矿化结节和红色脂滴面积小,稀疏分布,;12%SMS组,PPDLSCs较静置组ALP活性进一步减小,ALP染色,茜素红染色和油红O染色更浅,而HPDLSCs较静置组,ALP活性明显增加,ALP和茜素红染色明显加深,呈砖红色,镜下矿化结节和脂滴形成增多,脂滴间相互融合,呈片分布。Western Blot检测加力前后ALP和Runx2蛋白水平变化,其结果大体与茜素红染色和油红O染色结果一致。ALP和Runx2蛋白的表达相同处理组PPDLSCs表达明显弱于HPDLSCs,12%下调PPDLSCs而明显上调HPDLSCs的ALP,Runx2蛋白的表达。LSCM观察细胞骨架的改变,发现静置组PPDLSCs和HPDLSCs细胞内的骨架纤维均彼此交错排列呈网状,但PPDLSCs胞内应力纤维的数量明显较HPDLSCs少,且纤维的较纤细,不如HPDLSCs粗壮清晰;而12%SMS组,PPDLSCs胞体周围皱缩,骨架微丝变得更加的纤细,形态模糊,F-actin的排列方式较为随意;而HPDLSCs胞体被拉伸,出现明显的细胞骨架重排现象,与细胞体的变化趋势大体一致,即骨架微丝沿着细胞长轴方向彼此平行排列,与牵张力方向垂直,骨架纤维也更为致密。蛋白定量分析显示,静置组PPDLSCs中Rho-A,ROCK1,p-cofilin蛋白表达均不同程度的小于HPDLSCs,而cofilin,,Rho-GDIα水平略高。加力组,PPDLSCs中Rho-A,ROCK1,cofilin表达水平进一步下调,p-cofilin,Rho-GDIα水平升高,甚至高于加力组的HPDLSCs二者的表达水平;HPDLSCs施加12%SMS后,Rho-A,ROCK1,p-cofilin明显升高。3.应用Y27632预处理PPDLSCs和HPDLSCs,细胞周期检测显示,PPDLSCs静置组<HPDLSCs静置组;PPDLSCs PI值由大到小依次为:静置组>DMSO加力组>Y27632加力组;HPDLSCs PI值依次为:DMSO加力组>Y27632加力组>静置组。成骨诱导后,PPDLSCs茜素红染色及ALP,Runx2蛋白定量水平与细胞周期检测结果一致;而对于HPDLSCs,DMSO加力组染色最明显,形成的矿化结节最多,面积大且染色最深,而对于静置组和Y27632加力组,HPDLSCs钙化结节的形成基本无差别,成骨蛋白ALP的表达由高到低依次为DMSO加力组>静置组>Y27632加力组;Runx2蛋白的表达依次为DMSO加力组>Y27632加力组>静置组;相同处理组内PPDLSCs茜素红染色,钙化结节量,成骨蛋白表达均弱于HPDLSCs。对细胞骨架进行观察和蛋白分析显示,对于PPDLSCs而言,Y27632的加入较DMSO加力组进一步抑制了12%SMS诱导的细胞形态学的改变及细胞骨架的重组,h PDLSCs细胞体积减小,变得较为圆润,失去原有的梭形形态,细胞边缘出现向细胞质凹陷的情况,细胞骨架杂乱无序,稀疏排列,而蛋白分析显示,DMSO加力组ROCK1,p-cofilin,Rho-A蛋白水平下调,而负向调节蛋白cofilin,Rho-GDIα水平高于静置组;对于HPDLSCs,Y27632的加入使得细胞出现类似与PPDLSCs的情况,但不同之处在于HPDLSCs较实验组PPDLSCs细胞体积较大,细胞稍细长,细胞边缘凹陷程度也不如PPDLSCs明显,Y27632的干预同样使得12%SMS介导的ROCK1,p-cofilin,Rho-A的表达受到抑制,同时cofilin,Rho-GDIα的表达反而增强。实验结论1.炎症微环境可一定程度上提高hPDLSCs增殖能力,减弱其多向分化的潜能和影响细胞骨架的重组。2.与健康组织来源的h PDLSCs相比,炎症微环境明显削弱了h PDLSCs对机械应力的耐受性,细胞的自我增生修复能力;而细胞骨架对机械应力的高敏感性也会因为炎症的存在影响细胞骨架的调节能3.炎症微环境和机械应力协同作用影响Rho信号通路对细胞骨架重组的调节和h PDLSCs的增殖分化能力。