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目的 1 人血小板因子4(h PF4)原核高效表达克隆的构建 2 重组h PF4的表达及分离、纯化工艺研究 3 重组h PF4的特性研究 方法 根据原核细胞表达真核蛋白的基因表达调控特点，设计合成一对特异引物，在PT7-7-r PF4表达质粒的基础上，应用聚合酶链式反应(PCR)对其c DNA进行改造，通过DNA重组技术构建成重组h PF4原核表达质粒PBV220-r hPF4，用快速PCR检测法、DNA测序分析，鉴定重组h PF4表达质粒的正确性。 PBV220-r hPF4用氯化钙法转化大肠杆菌DH5 α、BL21(DE3)，温控诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blotting鉴定表达产物。采用超声结合溶菌酶法破碎大肠杆菌，分析蛋白表达形式，可溶性重组蛋白部分用肝素—琼脂亲和层析、RP-HPLC纯化重组h PF4，非可溶性部分经包涵体分离、洗涤纯化。研究重组h PF4的复性条件，采用空气氧化法使重组h PF4正确重折叠。采用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验观察重组h PF4的血管生成抑制活性及复性效果。 结果 1 DNA测序证明PBV220-r hPF4表达质粒构建成功。PCR扩增得到的h PF4基因片段去除了h PF4 c DNA 3末端AT富含的侧翼区序列，原终止密码子TAG定位突变为原核系统强的串联终止密码子TAATAA，3端设有SalⅠ位点，5、末端设有EcoR Ⅰ、NcoⅠ位点，h PF4基因片段以EcoR Ⅰ/SalⅠ位点定向插入PBV220载体。 山西医科大学2002届硕士学位论文 一 2 DHS a／PBV220－r hPF4经温控诱导表达后，SDS－PAGE及凝胶密度扫描分 析，表达产物占总国体蛋白的25－30％，凝胶迁移特性与hPF4标准品相同。 Western－blotting检测表达产物与兔抗人 h PF4抗体发生特异的抗原抗体反 应。表明我们成功构建了hPF4原核高效表达体系。 3 超卢结合溶由酶法破碎人肠杆菌后，经分析 r hPF4主要以包涵体的形式存＿在，包涵体经洗涤液I uOmMTrk－mPhs．趴10OmMN＊m：0．5mME0T儿 ZM瞧：0．2％TritonX－100 0．2％DOC）洗涤，再经洗涤液 11（50mol几，PH80 Trk．C卜mo＊M N＊m 山．5＊M EDTA：4M尿素：0．2％（Vv）Tr讨。＊x－100 0．2％DOC）溶解包涵体沉淀。r hPF4纯度可达 85％ 以上。r hPF4 E透析的 同时，采川立气氧化法，加以 Cu‘至终浓度川”mol／1加速空气氧化，使 r hPF4 上确显折叠。 4 鸡胚绒毛尿素膜血管生成抑制实验测定复性后的rhPF4的生物学活性，初 步结果显示：rhPF4具有野生蛋白抑制血管生成的活性。 结论 本研究运用 PCR定点突变技术，完全去除了 hPF4 cDNA基因 3”端 UTR AT 富含区：改用大肠杆菌强串联终止密码子T AAAATAA，成功构建高效表达克隆 PBV220－rhPP4。我们构建的r hPN原核高效表达系统经m－PAGE及凝胶密度 扫描分析结果表明，r hPF4表达量占菌体总蛋白量的 25－30％，较原表达克隆 PT7－7／r h PF4提高了近80倍，经快速高效的包涵体分高纯化工艺和复性工 艺，rhPF4具有野生蛋白活性。本研究为rhPF4的结构与功能关系研究及规模 化生产奠定了坚实的基础，也为真核蛋白在原核细胞中的表达调控机理提供 了理论依据。