论文部分内容阅读
微生物是地球上最大的生物资源宝库，嗜热微生物作为其一个重要的组成部分，由于生长环境的极端特殊性，使得它们具有了一套独特的酶系统和防御机制来适应这种对大多数生物来说是难以生存的环境。它们细胞和酶蛋白独特的耐热性和与之相适应的分子结构，使之成为了人们开发利用的重要生物资源，从中分离和提取的新颖工业酶和其他生物活性物质在基因工程、蛋白质工程、发酵工程及矿产资源的开发利用上均有很大的应用价值。更为重要的是，嗜热微生物在生物系统进化中具有特殊地位，蕴涵着生命进化历程的丰富信息，对其环境适应性机理等生理特征的研究，将对研究生命的起源，进而揭示生命现象的本质具有重要的意义。
本文从厦门周边地区温泉采集得到样品，在75℃和80℃的温度下进行培养并分离得到60株嗜热菌。由于传统上微生物主要依靠培养和生化等表型特征进行分类鉴定，较为烦琐。为了从大量的菌株中筛选出不同的菌株，有效的简化筛选过程，我们运用了细菌全蛋白SDS-PAGE电泳比较分析、RAPD比较分析和16S-23SrDNA间隔区比较分析等分子生物学方法从中筛选得到7株种属不同的嗜热菌，并进一步运用16SrDNA序列分析鉴定其种属关系，为进一步研究奠定了基础。
由于嗜热菌的最适生长温度比较高，因此其对环境温度变化的适应性不仅对其生存、生长至观重要，而且对于研究其与常温菌等其他微生物的关系，进而解开生命进化之谜具有重要意义。在筛选得到的菌株中，我们选取了WH-10作为进一步的研究对象，运用随机引物PCR技术(RandomarbitrarilyprimedPCR，RAP-PCR)，以最适生长温度(75℃)作对照，研究WH-10在最低生长温度(45℃)下基因表达的差异。通过对RAP-PCR优化，差异基因筛选的阳性率得到了极大地提高。在筛选到的53个差异片段中，我们选取了35个差异片段进一步用Northernblot进行验证，其中有18个差异基因证实在转录水平上存在着表达差异。这些基因主要涉及细胞膜表面结构的改变、转录调控以及生理代谢的适应性调整，比较全面的反映了嗜热微生物对低温环境整体的适应性，将有助于阐明嗜热微生物对环境温度的适应性机制。
在筛选到的栖热菌属(Thermus)的菌株中，我们分离到了其所携带的质粒。通过对质粒进行序列测定我们得到contig243、contig245、contig265和contig458等4个DNA片段。在进一步的序列分析、PCR扩增以及Southernblot验证的基础上，初步判定该菌携带有两个质粒，contig265组成pS4C，而contig243、contig245和contig458组成pL4C。通过对所得序列基因功能的预测，除了维持质粒自身复制所需要的replicationprotein外，在质粒上编码最多的基因是与DNA修复相关的基因(如DNAG：T-mismatchrepairendonuclease、C-5cytosine-specificDNAmethylase等)，另外，在质粒上还编码有transposase和integrase等遗传重组基因。进一步的测序分析将使我们获得质粒全序列，同时也将为我们阐明质粒上的基因功能，从而帮助我们了解质粒与嗜热菌宿主的关系。此外，对嗜热菌质粒改造的进一步研究正在进行之中。