Dicer是一种核糖核酸内切酶,属于RNase III家族,在进化上高度保守,是RNA干扰中的重要元件之一。果蝇(Drosophila melanogaster)Dicer2蛋白在R2D2等多个蛋白的帮助下能更好地发挥RNAi功能。相比之下,小菜蛾(Plutella xylostella)的Dicer蛋白及其互作蛋白还未有具体研究。因此,本实验着重研究小菜蛾Dicer2(Px Dicer2),运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达目的蛋白,并通过免疫共沉淀实验获得可能的互作蛋白,利用RNAi of RNAi技术分析相关蛋白对小菜蛾RNAi效率的影响,初步验证与Px Dicer2的互作关系。本实验通过两步法PCR扩增获得了Px Dicer2的全长序列,ORF为5085 bp;编码的蛋白含1694个氨基酸,具有解螺旋结构域、Dicer二聚体结构域、PAZ结构域(Piwi-Argonaute-Zwille domain)以及两个RNaseⅢ结构域,但缺少ds RBD结构域(double-stranded RNA binding domain)。运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,成功表达了融合蛋白EGFP-Dicer2,融合蛋白大小约230 KD。利用GFP-Trap?＿A beads在表达了融合蛋白EGFP-Dicer2的P.xylostella细胞裂解物中进行免疫共沉淀,得到了48种可能与Dicer2互作的蛋白。这48个蛋白的Gene ontology(GO)注释结果显示:在分子功能方面,42%的蛋白具有催化功能,39%的蛋白具有结合作用;在细胞组成方面,33%的蛋白是细胞的部分;而在参与的生物过程方面,39%蛋白参与了细胞过程,30%的蛋白参与代谢过程,还有15%的蛋白参与了生物调节。根据蛋白可信度得分以及蛋白功能注释,在获得的48个蛋白中选择8个候选基因进行RNAi,发现其中4个候选基因(0356,4974,3445,4479)的表达受到抑制。进一步对这4个基因进行RNAi实验,通过报告基因小菜蛾几丁质基因Px Cht转录水平的变化,初步验证候选蛋白与小菜蛾Dicer2的互作关系。实验表明,在分别共注射候选基因与Px Cht的ds RNA后,Px Cht的表达量在不同的时间点都有显著上升,说明这四个候选基因可能参与到了RNAi途径中,与Dicer2相互作用,影响RNAi的效率。其具体的互作方式还需在蛋白层面上做进一步的研究。