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饲料在制粒时温度70～80℃，易造成木聚糖酶大量失活，所以提高热稳定性直接关系到其在饲料工业中的应用前景，是当前急待解决的重大难题。本研究筛选出能产木聚糖酶的微生物；克隆并在大肠杆菌中表达了木聚糖酶基因或cDNA，对产物特性进行了系统研究；在此基础上，设计、构建并表达了耐热木聚糖酶杂合基因HX，系统地评价了表达产物活性和耐热性能。主要研究结果如下： 采用RBB-木聚糖水解透明圈技术，筛选出具有木聚糖酶活性的不同微生物。单位发酵液中木聚糖酶活性由高到低依次为黑曲霉FS6（木聚糖酶ANXW）、枯草芽孢杆菌2（酶BSXW）、环状芽孢杆菌BC（酶BCXW）和褐色高温单孢菌TF（酶TfxW）；对其主要生化特性研究表明，酶TfxW、BSXW、BCXW和ANXW最适反应pH分别为6.0、6.0、5.0和5.0，最适反应温度分别为70℃、60℃、50～60℃和50℃；酶BSXW、BCXW和ANXW在低温下活性较高，而TfxW在高温下酶活相对较高。 采用基因克隆技术，分别克隆了枯草芽孢杆菌2、环状芽孢杆菌BC和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA。枯草芽孢杆菌2和环状芽孢杆菌BC木聚糖酶基因长度均为702bp，开放阅读框架（ORF）为39bp～680bp，编码213个氨基酸；褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因长度为1067bp，ORF为31bp～1047bp，编码338个氨基酸；黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA长度为720bp，该序列是一个初级转录本，含有一个49bp（265bp～313bp）的内含子，外显子cDNA序列编码211个氨基酸。上述基因或cDNA与T-vector连接后，分别获得了重组克隆载体pGEM?-T Easy BSX Vector、pGEM?-T Easy BCX Vector、pGEM?-T Easy Tfx Vector和pGEM?-T Easy ANX Vector。 采用亚克隆技术，以pET-30（a）+为表达载体，在E. coli BL21中表达了枯草芽孢杆菌2和褐色高温单孢菌TF木聚糖酶基因以及黑曲霉FS6木聚糖酶cDNA，分别获得了阳性重组表达子E. coli BSX、E. coli Tfx和E. coli ANXE，其中E. coli ANXE表达产物为包涵体，经复性具有木聚糖酶活性。 分离和纯化了基因工程菌E. coli BSX和E. coli Tfx表达产物，对它们的生化特性进行了系统研究。E. coli BSX和E. coli Tfx在LB培养基中37℃下分别培养16h，单位发酵液中木聚糖酶活性分别为10.18U/ml和27.63U/ml。SDSPAGE凝胶电泳检测表明，木聚糖酶BSX分子量为20.31kDa，Tfx分子量为31.98kDa，它们均为成熟肽。BSX的最适反应温度为50～60℃，低温时酶活高于高温，40℃以下相对稳定，50℃以上酶活损失较大。Tfx的最适反应温度为70℃，低温条件下活性较低；60℃以下相对稳定，70℃以上酶存活率迅速下降。BSX的低温酶活性优于Tfx，但Tfx的耐热性能优于BSX。BSX最适反应pH为6.0，耐热木聚糖政杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究博士学位论文在pHS.07.0之间酶活性较高，pH4.0一7.0之间较为稳定;T丘的最适反应pH为6.0，在pHS.07.0之间酶活性较高，pHS.0一9.0之间较为稳定。 通过对木聚糖酶BSX和T丘的成熟肤氨基酸序列同源性和二级结构单元的分析，设计并构建了耐热杂合木聚糖酶分子，通过表达获得了耐热杂合木聚糖酶基因工程菌E.coli HX，分离和纯化了表达产物，进而系统研究了其酶学特性。以pGEM叱T Easy BSX Veetor为模板，SRBsX02、3RBsX01（含限制性内切酶劝01）为引物扩增出532bp基因片断;以pGEM吼T EasyT丘Vector为模板，5拙sxol（含限制性内切酶B田刀Hl）、3盼sx02为引物扩增出1一7bp基因片断;以这两个基因片段为模板，SRBsX01、3RBsX01为引物，采用基因拼接技术（SOE）构建了长度为628bp的木聚糖酶杂合基因，获得了含杂合基因的重组质粒 poEM叱T Easy HX Veetor。将经BamHI和乃01双酶切获得的杂合基因连接到经相同酶切的pET 30a（+）表达载体中，并导入到E.coli BL21中表达。采用RBB一木聚糖水解透明圈技术，获得了基因工程菌E.coli HX菌株。在LB培养基中37℃下培养16h，该基因工程菌单位发酵液酶活性为288U/ml;与出发菌株的枯草芽抱杆菌2和褐色高温单抱菌TF及其基因工程菌E.coli BSX和E.coli Tfx相比，酶活分别提高了3.77倍、6.50倍、27.29倍和9.42倍。酶学特性研究表明，杂合木聚糖酶HX分子量为27.2 kDa，最适反应温度为50一60℃;模拟饲料制粒温度，经70℃、80℃和90℃处理Zmin，HX存活率分别为96%、74%和48%，而亲本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分别为17%、9%、2%和78%、40%、12%，与BSX和Tfx相L匕，HX分别提高了4.65倍、7.22倍、23.00倍和0.23倍、0.85倍、3.00倍。杂合木聚糖酶HX最适反应pH为6.0一7.0;最稳定pH为5.0一7.0。在37℃、pH6.0（模拟动物小肠生理环境）条件下，相同酶活的HX在RBB一木聚糖平板上的水解透明圈显著大于木聚糖酶Tfx和BSX;在pH6.o、400C保温4omin，HX使木聚糖粘度下降2 5.15%，而BSX和Tfx分别下降9.09%和0%。