脐血作为一种新的造血干细胞来源，可以成功地替代骨髓和动员外周血用于临床上骨髓衰竭病人的造血重建，这己经被越来越多的临床实验研究所证明。这是因为脐血中含有丰富的CD34+造血干细胞。另外脐血移植后移植物抗宿主疾病（GVHD）的发生率和严重程度也比骨髓和动员外周血细胞移植低。但是由于单份脐带血中所含有的造血干细胞数量较少，限制了脐血移植的应用，目前脐血移植主要用于儿童和低体重成人患者。为了扩大脐血移植的应用范围，首先必须对脐血造血干细胞进行分离和体外扩增，这也是目前移植领域中倍受关注且急需解决的课题之一。分别采用Ficoll密度梯度离心、自然沉降和明胶沉降三种方法分离MNC。实验结果表明：在所对比的三种分离方法中，以自然沉降法和明胶沉降法的细胞得率较高（分别为79.76±2.74%和83.26±3.84%），两者在分离MNC的效果上无显著性差异（P>0.05）；而Ficoll法细胞得率相对比较低（56.27±3.40%），且在分离MNC的效果上与自然沉降法和明胶沉降法均存在显著性差异（P<0.05）。半固体集落检测结果表明：Ficoll法和自然沉降法的造血集落回收率较低（分别为59.26±4.38%和68.22±3.21%），且对MNC增殖能力的影响基本无显著性差异（P≈0.05）；明胶沉降法造血集落回收率最高（83.51±3.83%），且在对MNC增殖能力的影响上与前两者有显著性差异（P<0.05）。由于造血干细胞主要分布于CD34+细胞群体中，因此采用免疫磁珠法纯化脐血单核细胞中的CD34+造血干细胞，并用流式细胞术检测所分离得到的CD34+细胞的纯度。实验结果表明：经过分离柱一步纯化，CD34+细胞纯度可达70.98%，富集倍数44.1，回收率35.27%。考察了细胞因子单因素对CD34+细胞扩增的影响。实验结果显示对于细胞体外培养形成造血集落单位（CFU）的影响，G3的作用最明显，集落扩增倍数最大（6.93±1.72）；其次是SCF（5.84±1.84）和IL-6（1.63±0.17）；G-CSF集落扩增数最少（1.13±0.12）。另外实验结果还显示细胞因子单独作用均不能对细胞进行有效的扩增，一般扩增倍数不超过10。应用均匀设计法考察了细胞因子浓度及其组合对总细胞数和集落扩增的影响，得出细胞因子组合的最佳浓度为：SCF 60ng/ml，G3 30ng/ml，IL-6 10ng/ml。<WP=4>用此最佳条件对细胞进行14天的短期液体培养，总集落扩增倍数为10.39±0.17，结果表明采用均匀设计所回归出的方程能够比较真实地反映各因素及其交互作用对细胞扩增效果的影响，对于脐血造血干细胞体外扩增培养条件的研究具有较强的指导意义。考察了静置培养时不同细胞接种密度和换液方式对细胞体外扩增的影响。实验结果显示低细胞接种密度（103cells/ml）时，换液次数过频（每3天半量换液）会使扩增效果明显偏低，（MNC：84.15±4.26；CFU：27.24±1.97）；高细胞接种密度（105cells/ml）时，增加换液次数（每3天半量换液）可以明显改善扩增效果（MNC：137.10±4.04；CFC：43.21±2.22）。采用104cells/ml密度接种，每7天半量换液，体外培养14天后可使MNC扩增121.64倍，CFU扩增46.30倍。综合考虑，细胞静置培养时，以初始接种密度1～5×104cells/ml，每周半量换液为宜。在最适培养条件下考察了体外长期液体培养过程中总细胞数和CFU数的扩增情况。实验结果显示：培养4周后，总细胞数可扩增达1200倍以上，而且还没有衰退的趋势；而CFU的扩增倍数在第2～3周达到高峰（扩增倍数45～50倍），以后逐渐降低。综合考虑，以2～3周左右收获细胞为宜。