目的：构建无乳链球菌pgk基因抗原优势区序列的重组原核表达载体,转入大肠杆菌中表达,并对其表达蛋白的反应原性进行鉴定。　　 方法：提取无乳链球菌临床分离菌株基因组DNA,根据GenBank公布的无乳链球菌pgk基因序列,应用DNAStar软件的Protean程序预测pgk基因抗原表位、亲水性和抗原性指数等参数,并设计引物,PCR扩增出pgk基因抗原优势区序列。将其插入至表达质粒pET-30(a)的多克隆位点(MCS),构建重组表达质粒pgk—pET-30(a),将pgk—pET-30(a)转入BL21(DE3),IPTG诱导表达并优化诱导表达条件,应用SDS—PAGE电泳分析表达蛋白图谱。利用Western-blot验证重组表达蛋白的反应原性,运用Ni2+亲和层析法在自然条件下纯化并获得重组蛋白。　　 结果：经测序和酶切分析结果表明,克隆获得了无乳链球菌pgk基因抗原优势区序列,且插入片段读码框架正确,原核表达重组质粒构建正确。经IPTG诱导,pgk-pET-30(a)/BL21(DE3)表达出相对分子质量为35 KD的可溶性融合蛋白,表达量占菌体总蛋白量的43.8％。Western-blot结果表明重组蛋白具有良好的反应原性,纯化后蛋白含量为5.03mg/mL。　　 结论：成功克隆牛乳腺炎无乳链球菌pgk基因抗原优势区序列,该序列长度为984bp,编码328个氨基酸残基,构建的重组表达载体在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,并验证了重组pgk蛋白的反应原性,为奶牛乳腺炎的检测及流行病学调查提供理论和技术上的支持。