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嗜热厌氧杆菌（Thermoanaerobacter ethanolicus）具有代谢速度快、水解纤维素能力强、戊糖转化率高等特点。利用嗜热厌氧杆菌进行纤维素乙醇的高温发酵,有望实现木质纤维的降解和乙醇的发酵、蒸馏的同步进行,从而最大限度地降低纤维素乙醇的生产成本。但是目前嗜热厌氧杆菌发酵生产乙醇的浓度还很低,要提高嗜热厌氧杆菌乙醇的产量,首先要解析其乙醇代谢网络,找到其中与乙醇代谢密切相关的酶,及其调控蛋白,才能对其进行代谢工程,从而提高乙醇产量。因此本文要实现的主要目标是:解析嗜热厌氧杆菌的乙醇代谢网络,阐明还原力感应蛋白RSP介导糖酵解和乙醇代谢的分子机制,为嗜热厌氧杆菌的代谢工程提供靶点。1.通过模拟生理条件对嗜热厌氧杆菌乙醇代谢关键酶的催化特性进行了研究,发现脱氢酶AdhB主要表现为醇脱氢酶的活性,在乙醇浓度较低的时候（乙醇浓度2 mmol/L）,AdhB主要表现出催化乙醛到乙醇的活性,而当环境中的乙醇达到一定浓度的时候（乙醇浓度1 %）,AdhB的催化特性发生逆转主要表现为催化逆反应,即消耗乙醇;脱氢酶AdhE主要表现为醛脱氢酶活性,而且其催化特性与pH密切相关,在pH 7.2的环境下AdhE的逆反应,即催化乙醛生成乙酰CoA的比酶活为45.05±0.93 U/mg,高于正反应的比酶活35.61±2.51 U/mg;而在pH 6.6的环境下AdhE的正反应的比酶活为113.35±4.76 U/mg,远远高于逆反应的比酶活29.33±2.09 U/mg。由此可见,AdhE在嗜热厌氧杆菌乙醇代谢中主要推动正反应,即有利于生成乙醇,而AdhB主要起消耗乙醇的作用。2.首次在嗜热厌氧杆菌中发现了能对乙醇代谢关键酶基因进行调控的蛋白PadhE-1和PadhE-2 （RSP）,并对它们进行了克隆,表达和纯化,利用在线分析软件对调控蛋白的二级结构和三维结构进行了预测。通过比对发现调控蛋白PadhE-1与全局调控因子CcpA具有同源性,而RSP具有NAD（P）-binding结构域,与还原力感应蛋白具有同源性。3.通过凝胶阻滞实验,发现1 mmol/L的NADH能完全抑制RSP与adhB的启动子区域(TRRadhB)和adhE的启动子区域(TRRadhE)的结合,而1 mmol/L的NAD+,NADP+,NADPH对RSP的DNA结合活性没有明显的影响;虽然NAD+并不能影响RSP的DNA结合活性,但是NAD+存在能影响NADH的作用;圆二色谱的检测结果表明,NADH能使RSP的α-螺旋减少和β?折叠片增加;体外转录实验证实RSP能抑制基因adhB的转录,而NADH能解除RSP对adhB转录的抑制,NAD+虽然不能解除RSP对adhB转录的抑制,但NAD+能干扰NADH的作用。还原力感应蛋白RSP是迄今首次发现的糖酵解途径与发酵途径之间的调控枢纽。4.确定了RSP与嗜热厌氧杆菌乙醇代谢关键酶基因adhB和adhE上游启动子区域的结合位点,得到了完全互补的回文序列-ATTGTTANNNNNNTAACAAT-;对回文序列进行了定点突变,分析了其碱基偏好性。研究发现序列与回文结构越接近,其与RSP的结合力越强。这些结果说明,嗜热厌氧杆菌能通过操纵序列碱基差异而对乙醇代谢进行精密调控。5.通过对嗜热厌氧杆菌进行代谢工程,发现导入adhE基因能增加乙醇产量。对adhE启动子的重新设计,解除RSP对adhE基因的转录抑制并不能进一步提高乙醇的产量。由此可见,进一步提高乙醇产量的关键在于提高乙醛到乙醇催化效率,同时要降低乙醇的消耗速率。