二斑叶螨已成为温室及大田作物的主要害虫之一,由于其防治长期大量使用化学杀虫(螨)剂,产生了一系列的负面影响,如害螨抗药性的发展、天敌数量减少、环境污染加重、人类健康受损等,以致公众对环境和化学农药使用安全性的关注日益提高,促使农业生产改变害虫防治策略。微生物杀虫(螨)是解决过度使用化学杀虫(螨)剂的可行途径之一,很多病原菌已经作为害螨防治潜在药剂进行了研究,其中真菌是一个重要类群。本论文对共生菌——二斑叶螨类酵母共生菌、寄生菌——近缘寄主的蛛生真菌的生防潜力进行研究,以期为二斑叶螨绿色防控提供新的资源及基础资料。研究结果如下:1.二斑叶螨存在类酵母共生菌。在搜集前人研究类酵母共生菌18S引物的基础上,综合筛选出引物NS1-NS2作为后续工作采用的引物;通过对引物NS1-NS2扩增出的序列构建系统发育树,得到序列以高的支持率(100/99/98)聚成一个独立的分支,且与病原菌Hypomyces chrysospermus具有相对较近的关系;系统发育地位分析得到其与虫生真菌细脚拟青霉(细脚棒束孢)Paecilomyces tenuipes,球孢白僵菌Beauveria bassiana和布氏白僵菌Beauveria brongniartii聚集成一个亚分支,均属于子囊菌亚门,且与系统发育网络分析结果一致;根据其形态有两种形状的类酵母共生菌——柱状或椭圆形,近球形。2.不同螨的类酵母共生菌差异显著。通过对7种螨的类酵母共生菌的研究,发现均与其他已报道的类酵母共生菌关系较近,属于子囊菌亚门;7种不同螨扩增的类酵母共生菌(下文以螨名代指)序列碱基含量存在差异,腺嘌呤(碱基A)在四个碱基中的含量普遍最高,但懒甲螨的鸟嘌呤(碱基G)的含量最高;G+C含量比也均不相同,含量比最高的是河湿螨,其平均值为51.4%;含量比最低的是二斑叶螨,其平均值为43.4%,因而7种不同类型螨的类酵母共生菌也不同,且革伊螨,懒甲螨和绒螨关系近;通过对7种不同类型螨组内及组间的遗传距离分析,得到其组间的遗传距离均不相同,且二斑叶螨类酵母共生菌的组内遗传距离最大,达314.333。3.取食不同植物的二斑叶螨类酵母共生菌的遗传差异显著。通过对9种不同宿主植物的二斑叶螨类酵母共生菌(下文以宿主植物名代指)的四种碱基的含量百分比统计可得出,短荚豇豆、番茄、马铃薯、番薯、萝卜、豇豆和西葫芦的胸腺嘧啶(碱基T)的含量较高,而上海青和亚洲棉的腺嘌呤(碱基A)的含量较高;G+C含量百分比显示,短荚豇豆、马铃薯、萝卜、豇豆、上海青、西葫芦的百分比介于45.1-45.5%之间,番茄和番薯均高于上述宿主植物二斑叶螨类酵母共生菌的含量百分比,而亚洲棉的则低于上述值;番茄、番薯和亚洲棉的组内遗传距离最大,可达110.833;番茄、番薯和亚洲棉与其他不同宿主植物的二斑叶螨类酵母共生菌的遗传距离大,可达132.750;DNAsp v5软件计算得到22个单倍型,共分成5个分支,说明二斑叶螨体内存在至少4-5个不同的类酵母共生菌类群。4.建立5个新种并首次发现白僵菌属和枝穗霉属的蛛生真菌。通过在贵阳地区采集罹病蜘蛛和昆虫标本25号,分离鉴定获得11个菌株。经分子鉴定和形态分类,建立了5个新种——蛛生枝穗霉、淡黄棒束孢、蛛生蜡蚧菌、蛛生白僵菌、松毛虫绿僵菌,确认了已知种粉质棒束孢的1个蛛生真菌新分离株,分别为:淡黄棒束孢DX1,DX2,QLS1,QLS2,SN1;蛛生蜡蚧菌GZU1032Lea;蛛生白僵菌GZU0317bea;蛛生枝穗霉QLS0625clo和松毛虫绿僵菌IFR1006;粉质棒束孢新分离株DX3。另有1个白僵菌待定种菌株GZU12141。其中白僵菌属和枝穗霉属寄生蜘蛛为首次发现。5.确证了蛛生真菌对二斑叶螨的致病性。实验室筛选对二斑叶螨最具致病性的蛛生真菌显示,四个浓度范围内均对二斑叶螨具有致病性,且与分生孢子的浓度相关。当分生孢子的浓度为1×108个/mL时,菌株GZU0317bea与GZU1032Lea所导致的死亡率最高,可分别达到95.2%和95%,而死亡率最低为菌株QLS1,仅为80%。对蛛生真菌的碱性蛋白酶活性的测定,结果显示碱性蛋白酶活性最高的菌株为GZU12141,其酶活性可达32.38 U/mL;碱性蛋白酶活性最低的菌株为DX2,其酶活性为5.29 U/mL。因而,碱性蛋白酶可能作为筛选对二斑叶螨具有高致病性的蛛生真菌的筛选指示物。6.明确了蛛生真菌对二斑叶螨侵染相关酶及其活性变化。蛛生白僵菌在由二斑叶螨成螨粉末制成的培养基中培养7天,碱性蛋白酶、脂肪酶和几丁质酶均产生了明显的变化。其中碱性蛋白酶的最高酶活出现在第2天,脂肪酶的最高活性出现在第6天,几丁质酶酶活最高出现在第7天。因而本研究中,蛛生白僵菌侵染二斑叶螨的酶依次出现的顺序为:碱性蛋白酶,脂肪酶,几丁质酶。7.明确了二斑叶螨相关解毒酶和保护酶的变化。当两株菌处理二斑叶螨后,其免疫系统迅速作出了反应。第1天时,解毒酶系中的三种酶活性均显著增加,保护酶系中除超氧化物歧化酶外,其余两种酶活性也显著增加。菌株GZU12141导致羧酸酯酶酶活第5天达到最大值为1.34 U/mL;谷胱甘肽-S-转移酶酶活在第4天达到最大值为20.316 U/mL;过氧化氢酶酶活在第2天达到最大值为14.916 U/mL;超氧化物歧化酶酶活在第2天达到最大值为14.88 U/mL;过氧化物酶酶活在第4天达到最大值为0.015 U/mL;多酚氧化酶酶活在第3天达到最大值为6.7 U/mL,菌株GZU0317bea所导致的酶活变化与菌株GZU12141的相似。在解毒酶系的三种酶中,起主要作用的为谷胱甘肽-S-转移酶。而在保护酶系中,起主要作用的为过氧化氢酶。本研究确证了二斑叶螨体内存在类酵母共生菌及其随宿主植物变化而变化等特性;发现了白僵菌属和枝穗霉属等的蛛生真菌新资源,证实了蛛生真菌对二斑叶螨的致病性并明确了高致病性菌株;阐释了二斑叶螨体内防御相关酶、真菌侵染相关酶类的活性表现。这些成果扩大了虫生真菌资源、明确了应用潜力,是螨类绿色防治基础研究的理论创新,对进一步开展生防真菌制剂的开发利用具有重要实践意义。