研究背景和意义热射病（heat stroke,HS）是热病（heat illness）中对机体损伤最严重、危害最大的一种疾病,其临床症状主要是体温过高和中枢神经系统功能障碍,并伴有横纹肌溶解、弥散性血管内凝血（disseminated intravascular coagulation,DIC）、全身多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）、全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）等严重并发症,其死亡率15⁵0%。由于中枢神经损害是热射病主要临床特征,大脑成为热射病公认的主要损伤靶器官之一,因此热射病中枢神经系统损伤机制及防治措施研究备受关注。有关热射病中枢神经损伤机制目前普遍认为主要是高热对中枢神经细胞的直接打击以及热射病过程中脑水肿、脑缺血、缺氧导致中枢神经细胞继发性损伤。热射病脑损伤的防治措施主要包括高压氧和降温等物理手段,以及靶向功能蛋白干预和干细胞移植等生物手段。随着热射病发病机理的不断探索,近年来研究发现热射病中枢神经系统（central nervous system,CNS）炎症的发生发展与脑损伤程度密切相关。但由于对热射病中枢神经炎症的分子机制还缺乏深入系统研究,也限制了针对神经炎症开展热射病脑损伤的临床救治。小胶质细胞作为中枢神经系统炎症调控的重要效应细胞,在脑外伤、脑缺血以及神经退行性变等诸多神经系统疾病中被激活,呈现出M1型表型活化,具有促炎症反应的致伤特性。但小胶质细胞参与热射病中枢神经系统炎症发生及中枢神经损伤的具体机制目前仍不清楚。因此,揭示小胶质细胞M1型活化在热射病中枢神经系统炎症发生及中枢神经系统损伤中的机理,有望为以小胶质细胞为靶标治疗热射病中枢神经损伤提供参考,对探寻有效神经保护性药物,维护普通人群和职业人群健康具有重要作用。热休克蛋白（heat shock protein,HSP）是细胞在高温、缺氧、寒冷、创伤、感染等应激原诱导下所生成的一组遗传保守的应激蛋白。小胶质细胞热应激后必不可免地会产生热休克蛋白,近年来很多研究已证实热休克蛋白参与调节免疫和控制炎症反应,因此,在高热诱导小胶质细胞M1型活化过程中,极有可能受HSP的调控。而HSP90是已报道最为广泛的促炎相关调控因子,在脓毒症、关节炎、肠炎、多发性硬化症、红斑狼疮等多种炎性疾病中可募集多种炎症信号分子,诱导促炎症因子的产生。HSP90生物学功能的发挥有赖于其HSP90α和HSP90β两种亚型的作用。研究发现,HSP90α可能与肿瘤发生、增强的细胞周期调节、细胞应激时的快速保护等有关;而HSP90β可能与癌症、炎症等细胞功能调整有关。因此,我们推测热射病过程中HSP90β可能参与调控高热刺激小胶质细胞M1型活化。因此,本课题通过构建热射病小鼠模型,观察热射病后中枢神经系统病理改变和炎症反应,检测小胶质细胞M1型活化标志物的表达规律;并在离体小胶质细胞热休克模型上,观察了M1型活化标志物、炎症因子和HSPs三者的表达规律及相关性;采用抑制剂干预证明HSP90及其亚型在调控热休克小胶质细胞M1型活化中的作用,并从MAPK、STAT3、NF-κB炎症信号通路探讨HSP90β调控小胶质细胞M1型活化的机制,为临床靶向HSP90β干预热射病中枢神经系统炎性损伤的治疗提供实验基础。研究方法1,取雄性健康BALB/c小鼠,12周龄,在设定温度42.0℃,湿度60%的环境模拟舱中,持续暴露至小鼠核心温度达到42.7℃,完成热射病小鼠模型的构建。小鼠分成正常对照组（Con）、热射病后恢复即刻0 h组（HS-0h）、恢复3 h组（HS-3h）、恢复6 h组（HS-6h）、恢复24 h组（HS-24h）、恢复72 h组（HS-72h）、Ganetespib组（Gan）和Gan+HS组（恢复后6 h）。观测各组小鼠核心温度和体重变化,纪录死亡情况。于相应时相点取材脑组织,行HE染色病理观察。分析中枢神经系统炎症反应与脑组织损伤之间的相关性。2,对各组小鼠各取一边大脑皮层组织分别提取总RNA和蛋白。对各组细胞分别提取总RNA和蛋白。qRT-PCR法检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2和mPGES-1的mRNA表达。ELISA/EIA检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE₂蛋白分泌情况。探讨热射病小鼠和热休克小胶质细胞促炎症反应恢复变化的规律,以及抑制剂和esiRNA干预后炎症反应变化。3,取各组小鼠和细胞蛋白提取物,免疫印迹检测M1表型分子CD45、CD68、CD64和CD16蛋白表达,流式细胞术和免疫组织荧光检测CD45和CD68表达及定位情况。探讨热射病小鼠和热休克小胶质细胞M1型活化的变化规律,以及抑制剂和esiRNA干预对M1型活化的调控效应。4,取各组小鼠和细胞蛋白提取物,免疫印迹检测HSP70、HSP90α和HSP90β蛋白表达,ERK、JNK、p38、JAK2、STAT3、IκB-α和p65蛋白表达及磷酸化情况。免疫组织荧光检测Iba-1、HSP90β和p-STAT3荧光定位表达情况。从MAPK、STAT3和NF-κB炎症信号通路探讨HSP90β调控小胶质细胞M1型活化的内在机制。结果1,以42.0℃热暴露、小鼠核心温度达到42.7℃为阈值成功构建热射病模型小鼠,热射病小鼠恢复期3 h进入明显的低体温期,热射病恢复期6 h内脑组织病理明显改变、体重丢失显著、炎症因子mRNA表达和蛋白分泌增多、M1表型标志物表达增加;24h后仍有未完全恢复。表明热射病小鼠出现明显中枢神经病理损伤、中枢神经炎症以及小胶质细胞M1型活化。2,选取热暴露强度适中的42℃1.5 h热休克处理N9小胶质细胞,发现热休克小胶质细胞恢复期3 h和6 h炎症因子mRNA表达和蛋白分泌、M1表型标志物增加明显,随后均有所下降,但到12 h仍有部分指标仍未完全恢复。HSP27、HSP70和HSP90表达在热休克后12 h内均有不同程度增加,抑制剂分别干预HSP27、HSP70和HSP90,小胶质细胞促炎M1活化仅受HSP90抑制剂Gan调控影响。3,HSP90抑制剂Gan干预后热休克N9小胶质细胞信号转导分子ERK、JAK2和STAT3增强的磷酸化表达水平明显被抑制。ERK抑制剂干预对热休克N9小胶质细胞的炎症因子分泌无影响,而JAK2和STAT3磷酸化抑制剂可明显减少热休克N9小胶质细胞产生的炎症因子。esiRNA瞬时沉默HSP90α和HSP90β基因后结果发现,沉默HSP90β而非HSP90α,能显著抑制热休克N9小胶质细胞炎症因子的mRNA和蛋白表达的增加,并能显著消除热休克小胶质细胞JAK2和STAT3磷酸化表达水平的增加。4,脑立体定位注射Gan靶向HSP90β干预后,热射病小鼠大脑皮层组织脑水肿和炎性等病理损伤得以减轻,炎症因子mRNA表达和蛋白分泌、M1表型标志物荧光强度、STAT3磷酸化荧光强度和入核程度明显低于热射病小鼠,提示在体Gan干预能通过HSP90β–STAT3通路抑制小胶质细胞M1型活化减轻热射病中枢神经系统炎性损伤。全文结论1、热射病小鼠出现明显脑组织损伤病理改变,大脑皮层大量炎症因子产生、小胶质细胞特异M1型标志物激活,提示热射病中枢神经损伤与中枢神经炎症、小胶质细胞M1型活化密切相关。2、热休克诱导N9小胶质细胞炎症因子及M1活化表型分子的mRNA和蛋白表达都增加,表明热应激可直接刺激小胶质细胞出现M1型活化。HSP27、HSP70和HSP90表达在N9小胶质细胞热休克后12 h内均有不同程度增加,HSP90抑制剂Gan能有效抑制热休克对小胶质细胞炎症因子和M1表型标志物的增加,提示HSP90在调节热休克小胶质细胞促炎M1型活化中具有关键作用。3、HSP90抑制剂Gan明显抑制ERK、JAK2和STAT3的磷酸化表达水平增加,应用抑制剂分别干预ERK、JAK2和STAT3的磷酸化激活,结果发现只有JAK2–STAT3信号通路参与了Gan调节小胶质细胞M1型活化促炎反应。通过esiRNA分别沉默HSP90α和HSP90β,发现Gan通过调节HSP90β而不是HSP90α,逆转热休克诱导的N9小胶质细胞的炎症因子分泌增加和下游促炎信号通路蛋白激活。因此,结果提示HSP90β通过STAT3信号通路调节热休克N9小胶质细胞M1型活化产生促炎反应。4、Gan靶向干预HSP90β明显减轻热射病小鼠病理变化、炎症因子与M1表型标志物表达以及STAT3磷酸化,结果表明干预HSP90β可有效抑制小胶质细胞M1型活化,减轻热射病中枢神经系统炎症及中枢神经损伤,进一步证明热射病小鼠小胶质细胞M1型活化产生促炎反应主要受HSP90β-STAT3调控。