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目的：慢性粒细胞性白血病（CML）为多能造血干细胞恶性增殖性疾病，是慢性白血病中常见的一种类型，9号和22号染色体易位，形成BCR-ABL融合基因，导致酪氨酸激酶活性增加，这是慢性粒细胞白血病的发病机制[1-2].传统治疗药物羟基脲、沙利度胺、干扰素等虽然在一定时期内可以改善患者症状，但不能治愈本病，也不能从根源上阻断疾病进展。绝大多数患者在经过一段时期的慢性期后，进入加速期或急变期，最终因感染或骨髓衰竭等并发症而死亡。伊马替尼是一种酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors, TKIs），它对Bcr-abl激酶升高的白血病细胞有抑制增殖和促进凋亡的作用，目前已经作为治疗慢性粒细胞白血病的一线药物应用于临床。但在临床中发现，虽然伊马替尼对慢性粒细胞白血病慢性期有很好的治疗效果，很多患者可以实现Bcr-abl基因和费城染色体的转阴，但仍有部分患者出现耐药。研究证实Bcr/Abl激酶可以激活细胞内多种信号通路，影响细胞周期分布以及细胞凋亡等，导致慢性粒细胞白血病发病。其中，雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在慢性粒细胞白血病对TKIs耐药机制中发挥重要作用，抑制mTOR信号通路的异常激活有可能增强Bcr/Abl激酶阳性细胞对TKIs的敏感性.雷帕霉素是mTOR途径抑制剂，人们发现其具有免疫抑制和抗肿瘤的双重功效，并且在临床上也已经应用于某些实体肿瘤的治疗，由此其在治疗造血系统恶性肿瘤方面的作用也正在被越来越多的人关注和研究。本课题组在长期从事白血病中信号转导作用机制的研究基础上，已经研究发现BCR-ABL融合基因存在时，SHIP基因的表达受到抑制，提示SHIP基因缺失或功能受抑是慢性粒细胞白血病发病的重要环节。目前临床应用伊马替尼作为治疗慢性粒细胞白血病的一线用药,其疗效显著，但患者发生耐药的问题也不容忽视。慢性粒细胞性白血病的发病机制是融合基因BCR-ABL编码的P210蛋白的酪氨酸激酶被异常激活,进而导致疾病的发生。因此一旦酪氨酸激酶蛋白浓度增加，细胞便会被重新激活过度增生,患者发生耐药。多种研究表明患者对伊马替尼发生耐药是多种机制的综合结果，且过程复杂，其具体机制也有待研究。针对其耐药的发生，我们可以联合传统的化疗药物，也可以联合其他信号转导抑制剂来发挥协同治疗作用。研究表明PI3K/AKT/mTOR途径是BCR/ABL融合基因下游的一条重要通路[3]，本实验拟在探讨雷帕霉素是否可以通过抑mTOR靶点的活性从而抑制白血病细胞株的生长，探讨mTOR通路抑制剂雷帕霉素对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞生长增殖与凋亡的生物学影响及K562细胞中SHIP基因表达情况，探讨mTOR通路抑制剂雷帕霉素与酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼在慢性粒细胞性白血病的治疗中是否存在协同作用，为临床治疗慢性粒细胞白血病探索新的方法和策略。方法：1MTT法检测不同浓度的雷帕霉素和伊马替尼单药及不同浓度伊马替尼联合单一浓度雷帕霉素对K562细胞增殖的影响。2流式细胞分析法检测不同浓度的雷帕霉素和伊马替尼单药及二者联合应用对K562细胞凋亡的影响。3Western Blot法检测SHIP基因在蛋白水平上的表达。4RT-PCR检测各组K562细胞SHIPmRNA表达变化。5统计学处理。结果：1雷帕霉素对K562细胞增殖和凋亡的影响不同浓度的雷帕霉素作用于K562细胞24h后，发现雷帕霉素抑制K562细胞增殖，并呈剂量依赖性,25、50、100、200、500、1000nmol/L处理组K562细胞存活率均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。在25～1000nmol/L浓度范围内，随着雷帕霉素浓度的升高K562细胞存活率均明显降低。而1、6.25、12.5nmol/L浓度雷帕霉素处理组对K562细胞存活率无明显影响（P>0.05）,其IC50为186.7nmol/L。雷帕霉素处理24h后，形态学观察发现K562细胞出现典型的凋亡，表现为胞膜完整，核固缩或核碎裂，可见凋亡小体。流式细胞分析显示，处理组G0/G1期细胞比对照组显著增多，而S期细胞比例则明显降低（P<0.05）。提示雷帕霉素可显著影响K562细胞周期分布，诱导细胞G0/G1期阻滞。2伊马替尼抑制K562细胞增殖诱导其凋亡不同浓度的伊马替尼作用于K562细胞24h后，发现伊马替尼抑制K562细胞增殖，并呈剂量依赖性,200、500、1000、2000nmol/L处理组K562细胞存活率均明显低于溶剂对照组（P<0.05）。在200～2000nmol/L浓度范围内，随着伊马替尼浓度的升高K562细胞存活率均明显降低。3雷帕霉素能增强伊马替尼对K562细胞的促凋亡作用选择低于IC50剂量的50nmol/L的雷帕霉素和不同浓度伊马替尼联合作用于K562细胞，联合用药组的细胞生长抑制率与两单药组比较均有统计学差异（P﹤0.05），说明雷帕霉素和伊马替尼联合作用在K562细胞上时，可产生增强效应。4雷帕霉素对K562细胞内mTOR表达的影响mTOR蛋白分子量为289kD，经SDS-PAGE电泳、转膜后，空白对照组、药物处理组均在289kD位置出现荧光条带。设定GAPDH为内参基因，定量分析荧光条带，结果表明，雷帕霉素处理后对K562细胞内mTOR蛋白的表达无明显影响（P>0.05），但对降低K562细胞内mTOR蛋白磷酸化水平的效果明显（P<0.05）。5雷帕霉素对K562细胞内SHIP基因蛋白的影响Western结果显示,白血病细胞株K562细胞内SHIP蛋白无表达,经雷帕霉素处理后K562细胞内表达SHIP蛋白，且呈现浓度依赖性，随着雷帕霉素浓度的增加，蛋白表达增加。6雷帕霉素对K562细胞内SHIP基因表达的影响RT-PCR结果显示不同浓度的雷帕霉素作用K562细胞24h，SHIP基因表达水平均比对照组表达量增高（P<0.05），且随着雷帕霉素浓度的增加而表达量增加。7伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达的影响RT-PCR结果显示，不同浓度的伊马替尼作用于K562细胞24h后，SHIP基因表达水平均比对照组表达量增高（P<0.05）,且随着伊马替尼浓度的增加而表达量增加。8雷帕霉素联合伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达的影响RT-PCR结果显示两药联合作用于K562细胞24h，SHIP基因表达量均较单药作用后表达量高（P<0.05）。结论：1雷帕霉素在一定浓度范围内能有效抑制K562细胞增殖，并呈浓度依赖性，并促进其凋亡,并使K562细胞内SHIP基因表达量增高，提示雷帕霉素可抑制慢性粒细胞白血病细胞的增殖。2伊马替尼在一定浓度范围内能有效抑制K562细胞增殖，促进其凋亡，并使K562细胞内SHIP基因的表达水平上升。3雷帕霉素联合伊马替尼在抑制K56细胞增殖，促进凋亡和使SHIP基因表达水平上方面均明显优于单药，表明雷帕霉素能增强伊马替尼抗K562细胞作用，对慢性粒细胞白血病的治疗可以在应用伊马替尼作为一线治疗药物的同时尝试联合应用雷帕霉素，以减少慢性粒细胞白血病患者对伊马替尼的耐药性，且亦可深入研究SHIP基因在慢性粒细胞白血病发病中的机制，为白血病的基因治疗提供科学的理论依据。