增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是1983年由美国视网膜专家协会提出用来描述孔源性视网膜脱离(rhegmatogenous retinal detachment,RRD)等疾病后玻璃体和/或视网膜前后面特异细胞增殖形成可以收缩的细胞性膜,进而引起视网膜牵拉、脱离与固定的一种病变,是一种常见的难治性致盲性眼病。据报道,5%~10%的RRD可继发PVR,而在复发性视网膜脱离(retinal detachment,RD)中,PVR的发生率增至75%。近年来,随着对PVR病理机制研究的逐渐深入,越来越多的研究发现表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)在RPE细胞的迁移、增生中起重要作用,是促进RPE细胞发生迁移进而发生PVR过程的关键因素之一。目前,临床上治疗PVR的主要方法就是玻璃体视网膜手术,但手术治疗效果并不理想,术后PVR的复发率较高。因此,随着对各种细胞和生长因子在PVR致病过程中作用机制了解的加深,针对PVR发展的不同阶段和相关因子采取不同药物来预防和治疗PVR成为目前进行研究的热点,并成为主流趋势。到现阶段为止,药物研究主要集中在西药领域,主要包括以下几类:皮质类固醇、维生素及其衍生物、抗代谢药、细胞外基质合成抑制剂和细胞信号转导抑制剂等。虽然应用西药来防治PVR的研究已有数年之久,但是由于其在眼内有较大的毒副作用、较单一的药理作用、较昂贵的价格等诸多的局限性致使迄今仍无一种特效的药物能够成功的在临床上得到广泛的应用。目前在西药上的研究难以取得突破性进展,那么应用我国传统中药来防治PVR的研究成为了充满希望的突破方向。中药具有药源丰富、作用广泛且毒副作用小等诸多优点,姜黄素是存在于姜科姜黄属植物根茎中的一种天然的中药单体成分,具有多种药理作用,例如抗炎症、抗细胞增生、抗微生物等。姜黄素的药理作用可以满足PVR防治药物的条件,并且安全性高、毒性低、药源广泛、价格低廉。我们的前期研究发现姜黄素具有抑制视网膜色素上皮细胞增殖的作用,那么姜黄素对在PVR形成过程中起重要作用的表皮生长因子是否有作用,本课题分别通过体外细胞实验和体内玻璃体腔注射姜黄素的动物实验研究姜黄素在pvr防治过程中对egf的作用和相关机制,为pvr的防治提供依据。第一部分表皮生长因子对体外培养的rpe细胞的作用及其在rpe细胞内的表达目的:研究egf对体外培养的兔rpe细胞的作用,探讨egf促进rpe细胞增殖的最佳质量浓度;观察egf在rpe细胞内的表达情况。方法:提取、培养青紫蓝兔rpe细胞,传至第三代并鉴定后,选取生长状态良好的第3代rpe细胞进行实验。将rpe细胞种植在载玻片上制备成细胞爬片,做免疫细胞化学染色进行rpe细胞鉴定和观察rpe细胞内egf的表达情况;将egf分为3、6、9、12ng/ml不同浓度组及空白对照组(10%fbs.dmem)4组;每组各设6个复孔,共接种3块培养板,加药后于24、48、72h随机抽取1块培养板采用四甲基偶氮唑盐(mtt)比色法检测不同浓度的egf在不同作用时间对rpe细胞增殖的影响。结果:rpe细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含有丰富黑色素颗粒,免疫细胞化学染色提示角蛋白表达强阳性。egf在兔rpe细胞的细胞质中表达阳性,呈棕黄色。在相同时间点、不同浓度egf作用下,rpe细胞的吸光度(od值)随egf的浓度增加而增加,且与对照组比较差异均有统计学意义(p<0.05)。egf浓度≥9ng/ml的相邻浓度实验组两组间比较差异无统计学意义(p>0.05)。在相同浓度的egf作用下,rpe细胞吸光值(od值)随时间的增加而增加,且与相邻组比较差异均有统计学意义(p<0.05)。结论:体外培养可以获得大量rpe细胞并可用于体外实验研究;egf在兔rpe细胞的细胞质中表达;egf对体外培养兔rpe细胞增生的调控存在一定的剂量-效应关系、时间-效应关系。egf对rpe细胞的促生长作用在9ng/ml以上逐渐达到饱和。研究结果提示:促体外培养的兔rpe细胞增殖的egf的最佳浓度为9ng/m1。第二部分姜黄素对体外培养的rpe细胞中egf表达的抑制作用目的:研究不同浓度的姜黄素对体外培养的rpe细胞中egf表达的影响,应用免疫细胞化学染色方法检测兔rpe细胞中egf的表达情况,寻找姜黄素抑制egf表达的最佳浓度;应用rt-pcr法、westernblot法检测姜黄素对兔rpe细胞中egfmrna和蛋白表达的影响,探讨姜黄素抑制egf的作用机制。方法:选取生长状态良好的兔第3代rpe细胞在盖玻片上制备成细胞爬片进行实验。分为空白对照组(含0.5‰dmso的10%fbs.dmem)和10、15、20ug/ml姜黄素4组;每组各设6个复孔,共接种3块培养板,加药后24、48、72h时随机抽取1块培养板行免疫组织化学染色,观察rpe细胞内egf的表达情况。rt-pcr、westernblot分别检测空白对照组(含0.5‰dmso的10%fbs.dmem)、姜黄素(15ug/ml)、egf(9ng/ml含0.5‰dmso)、egf(9ng/ml)+姜黄素(15ug/ml)作用24、48、72h后rpe细胞中egfmrna和蛋白表达的影响。结果:1不同浓度姜黄素对rpe内egf表达的抑制作用:时间依赖性:姜黄素各浓度组对rpe细胞内egf表达的抑制作用均随作用时间的延长而增强,各时间点之间差异均有统计学意义(p<0.05),姜黄素对rpe细胞内egf表达的抑制作用具有时间依赖性。剂量依赖性:姜黄素各时间点对rpe细胞内egf表达的抑制均随药物质量浓度的增高而增强,除姜黄素15ug/ml和20ug/ml组之间差异无统计学意义(p>0.05)外,其余各质量浓度之间差异均有统计学意义(p<0.05)。2姜黄素对rpe细胞内egfmrna转录的影响:向培养液中加入姜黄素使其浓度为15ug/ml,在24h、48h、及72h检测egf的mrna含量,可见随时间延长细胞内egf的mrna表达量下降,和对照组相比较,差异有统计学意义(p<0.05);不同时间点间做比较,相邻时间点组间相比差异均有统计学意义(p<0.05)。姜黄素对egf作用下rpe细胞中egfmrna表达量在各时间点和对照组比较差异有统计学意义(p<0.05),不同时间点间,相邻的时间组相比较差异均有统计学意义(p<0.05)。3姜黄素对rpe细胞内egf蛋白表达的影响:向培养液中加入姜黄素使其浓度为15ug/ml,作用24h、48h、及72h,随着时间的延长细胞内egf蛋白表达量逐渐下降,与对照组相比较差异有统计学意义(p<0.05);不同时间点间,相邻的时间组间相比较差异均有统计学意义(p<0.05)。姜黄素对egf作用下rpe细胞中egf蛋白表达量在各时间点和对照组比较差异有统计学意义(p<0.05),不同时间点间,相邻的时间组相比差异均有统计学意义(p<0.05)。结论:姜黄素在体外抑制兔rpe细胞内egf的表达,最佳抑制浓度是15ug/ml,姜黄素在体外可显著抑制兔rpe细胞内egfmrna和蛋白的表达。第三部分姜黄素在兔眼增殖性玻璃体视网膜病变中对egf作用的实验研究目的:研究姜黄素在体内兔眼增殖性玻璃体视网膜病变形成过程中对egf的作用及对pvr的防治作用。方法:选择正常青紫蓝兔30只,所有兔在玻璃体注射前均抽出0.2ml玻璃体,随机选取一眼纳入对照组:共30眼,玻璃体腔注射0.1ml(2×106)培养的生长状态良好的第三代同种rpe细胞和含0.5‰dmso的生理盐水0.1ml;另一眼纳入实验组:共30眼,玻璃体腔注射0.1ml(2×106)培养的生长状态良好的同种第三代rpe细胞和质量浓度为1mg/ml的姜黄素0.1ml。注射后3、7、14、21、28天进行裂隙灯显微镜检查观察眼前节和前部玻璃体情况,间接眼底镜检查观察眼底情况,眼底彩色照相,眼部b超检查观察玻璃体浑浊情况和视网膜有无脱离及脱离的程度,检查完毕后,在每个时间点随机抽取6只兔,12只眼,对照组6只眼,实验组6只眼,分别抽取玻璃体,采用兔表皮生长因子elisa试剂盒检测玻璃体液中egf的含量。结果:1前房反应:玻璃体腔注射后第3天对照组和实验组兔眼前房内均可见少量浮游物,第7天时均消退。2玻璃体和视网膜情况:第3天两组玻璃体均有浑浊,实验组玻璃体混浊轻,第7天时玻璃体内有增殖膜形成,对照组增殖膜多且厚,实验组增殖膜局限且薄;第14天时对照组视网膜脱离发生率(11/18)61%,实验组玻璃体内增殖膜较薄,视网膜脱离发生率(2/18)11%;第21天时对照组视网膜脱离发生率(8/12)67%,增殖膜上可见新生血管,实验组视网膜脱离发生率(2/12)16%,视网膜脱离范围小,第28天对照组视网膜脱离渐加重,并有新生血管生长,视网膜脱离发生率(5/6)83%,实验组视网膜脱离局限,发生率(1/6)16%;视网膜脱离发生率实验组和对照组比较差异显著,有统计学意义(p<0.05)。3玻璃体中egf含量测定(elisa结果):玻璃体液中egf含量对照组较高,实验组较少,各时间点实验组和对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:玻璃体腔内注射姜黄素可以有效抑制RPE细胞诱导的兔眼实验性PVR形成过程中表皮生长因子的水平,进而抑制PVR的发生和发展。